IL-10对细菌脂蛋白诱导乳鼠心肌细胞凋亡的抑制作用

黎志财 周 静 张 倩 朱冬梅 黄 敏 吴远帆 韩 艺 周苏明

(南京医科大学第一附属医院老年医学科ICU，江苏 南京 210029)

脓毒症是重症监护病房患者特别是老年患者主要的死亡原因之一，发病率和病死率较高。当细菌、病毒等病原微生物感染侵入血液循环时，其成分如细菌脂多糖(LPS)、细菌脂蛋白(BLP)、病毒DNA均可激活免疫系统，瀑布式地导致炎症反应的发生，破坏机体免疫平衡，损害机体组织器官功能。约50%的脓毒症患者伴有心功能障碍，病死率可上升到70%〔1〕。因此，防治脓毒症所致的心功能障碍具有重要的临床意义。白介素-10(IL-10)是一种多能免疫调节细胞因子，在多种心脏疾病中具有保护心功能的作用，但IL-10在脓毒症时对心功能的影响目前尚不是十分清楚。本文通过体外实验探讨IL-10对BLP诱导的心肌细胞凋亡的抑制效应。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 1～3日龄新生SD乳鼠，雌雄不限，由南京医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 试剂与仪器 BLP(美国Alexis公司);重组大鼠IL-10(美国Peprotech公司);DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司);胶原酶Ⅱ型、5-溴-2脱氧尿嘧啶(5-Brdu)(美国Sigma公司);半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)、bcl-2和bax蛋白一抗(美国 CST 公司)，β-肌动蛋白(β-actin)和 α-微管蛋白(α-tubulin)一抗、二抗(博士德公司)，辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔IgG(美国KPL公司);其他试剂均为分析纯;CO2培养箱(美国Thermo Forma公司);恒温摇床(上海新苗公司);小型垂直电泳槽、电泳电源及转移装置(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞培养 参考文献报道〔2〕，并加以改进。取1～3日龄新生SD乳鼠10只，在超净工作台中迅速开胸取出心脏放入预冷的D-Hanks盐平衡溶液中洗净残血，剔除心底部和心外膜的结缔组织，将心室肌剪成1 mm×1 mm×1 mm碎块。移入50 ml离心管中，加入0.06%的胰蛋白酶10 ml，37℃恒温摇床中消化10 min，弃去上层悬液(主要为血细胞和细胞碎片)。随后往下层组织块中继续加入0.08%的Ⅱ型胶原酶10 ml消化30 min，重复此步骤共消化2～3次，直至组织块消失为止。每次消化后的上层悬液移入4 ml胎牛血清中中和酶液。最后200目筛网过滤全部上层悬液，1 000 r/min、10 min离心，重悬细胞，接种于培养瓶中培养1.5 h，收集未贴壁的细胞用台盼蓝染色鉴定细胞活力，以一定的密度接种于培养板或培养皿中，置于37℃、5%的 CO2培养箱中培养2 d，换液后继续培养1～2 d，使心肌细胞状态达到最佳。

1.2.2 实验分组和处理 第一部分实验以1 μg/ml的BLP分别刺激乳鼠心肌细胞12、24、36、48 h，检测caspase-3的表达，观察BLP诱导心肌细胞凋亡的时间效应。第二部分实验将细胞分为五组，空白对照组:未予任何刺激;BLP组:以1 μg/ml的BLP刺激心肌细胞24 h;IL-10组:以20 ng/ml的IL-10刺激细胞24 h;IL-10+BLP组:在BLP(1 μg/ml)刺激细胞4 h之前加入 IL-10(20 ng/ml)，共处理 24 h;BLP+IL-10组:BLP(1 μg/ml)刺激细胞4 h后加入IL-10(20 ng/ml)，共处理24 h，检测caspase-3、bax及bcl-2的表达，观察IL-10对BLP诱导心肌细胞凋亡的影响。

1.2.3 Western印迹检测心肌细胞caspase-3、bax及bcl-2蛋白表达 心肌细胞接种于六孔板中，给药处理24 h后，弃去旧培养基，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞3遍，加入80 μl细胞裂解液，于冰上裂解0.5 h，用细胞刮收取细胞于1.5 ml离心管中，4℃、12 000 r/min，离心 20 min，小心吸取上层悬液，即为细胞蛋白。采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，调整各样本蛋白浓度为同一浓度，加入上样缓冲液，点样，Tris-十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胺垂直电泳1.5 h，转膜50 min，5%的脱脂牛奶封闭2 h，洗膜，然后分别以稀释后(1∶1 000)的一抗(caspase-3、bax和bcl-2抗体)4℃孵育过夜，再和二抗(抗兔IgG，1∶5 000稀释)4℃反应2 h，洗膜后于暗室内加入发光液反应1 min，曝光，显影，定影。条带扫描后，采用Quantity One图像分析系统，分别得到目的蛋白的灰度值，以α-tubulin作为内参，计算相对表达水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件进行分析，数据资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析;两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 乳鼠心肌细胞的培养 刚分离下来的心肌细胞呈球形，差速贴壁2 h后，收集未贴壁的心肌细胞接种于培养板中，24 h后大部分活细胞已贴壁，呈长梭形，偶见单个搏动的细胞;48 h后细胞贴壁完成，并逐渐扩展，呈多角形或不规则的星形，细胞较饱满。第3天开始细胞伸出伪足，并相互交接成网，心肌细胞逐步形成单层和放射状排列的细胞簇，每个细胞簇内心肌细胞的搏动实现同步化，搏动频率为60～80次/min。取第3～4天的细胞用于实验。

2.2 BLP诱导心肌细胞凋亡的时间效应 心肌细胞经BLP作用24 h即可观察到有活性的切割片段(cleaved caspase-3)表达水平明显升高，在36、48 h时表达量进一步上升;相反，其前体(procaspase-3)表达水平逐渐下降。选取24 h为下面实验的观测时间点。见图1。

图1 BLP对心肌细胞caspase-3表达的时间效应

2.3 IL-10对BLP诱导心肌细胞凋亡的影响 见图2。与正常对照组相比，在BLP组中BLP使心肌细胞cleaved caspase-3及bax的蛋白表达明显增加(P＜0.01)，而bcl-2/bax的比率明显降低(P＜0.01);与BLP组比较，IL-10+BLP组和BLP+IL-10组均能明显降低cleaved caspase-3及bax的表达(P＜0.01)，并且提高bcl-2/bax的比率(P＜0.01)。提示IL-10能够拮抗BLP诱导的心肌细胞凋亡。

图2 IL-10对BLP诱导的心肌细胞caspase-3、bax及bcl-2表达的影响

3 讨论

细胞凋亡维持着细胞存活与死亡的动态平衡，病理性的因素导致凋亡的不足或过盛均可引起疾病的发生。既往研究发现脓毒症小鼠心功能明显受到抑制的同时可观察到心脏p53表达显著升高，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导的凋亡亦明显增加〔3〕。心肌细胞属于终末分化期细胞，心肌细胞的过度凋亡在感染引起的心功能抑制中可能起到重要作用。脓毒症时过度的炎症因子如TNF-α产生是引起心肌凋亡的重要原因之一，而bax、bcl-2以及caspase-3在TNF-α诱导凋亡的机制中起到重要角色。bcl-2和bax在凋亡的细胞内途径中起到门控的作用，bcl-2可以抑制线粒体释放促凋亡蛋白，抑制凋亡蛋白酶的激活，而bax的作用与bcl-2相反，bcl-2和bax的比率是决定细胞命运的一个关键因素。caspase-3是凋亡至关重要的执行者，它负责对一些细胞存活所需的关键蛋白进行降解，如DNA修复酶。caspase-3的作用发挥需要其 procaspase-3裂解为cleaved caspase-3。然而，本实验发现BLP能够显著激活心肌细胞caspase-3，促进bax表达增加，从而使bcl-2/bax的比率降低，直接促进心肌细胞的凋亡。BLP是广泛存在于细菌细胞膜上的一种成分，能够诱导人单核细胞(THP-1)快速的释放TNF-α〔4〕，BLP促进心肌细胞的凋亡效应是否为其产生 TNF-α的能力所致，需我们进一步探讨。

IL-10是一种具有多效性的细胞因子，能够抑制多种炎症因子，如TNF-α和IL-1β的表达，并能够增加一些抗炎因子的表达，如IL-1受体拮抗剂和可溶性TNF-α受体。IL-10基因敲除小鼠表现出对内毒素血症过度的炎症反应〔5〕;Kaur等〔6〕发现实验大鼠在心肌梗死后第4、8、16周，IL-10的表达水平明显降低，这种下降趋势和心功能的恶化有着并行的关系;此外在病毒性心肌炎所致心力衰竭的模型中，应用外源性的IL-10治疗可明显降低小鼠的死亡率〔7〕;在最近的一项研究结果中发现，在心肌梗死的实验动物中，静脉注射IL-10后，心肌炎症因子和巨噬细胞浸润明显减少，并且可明显改善大鼠的左室功能〔8〕。以上研究表明，IL-10和心功能的改善有着密切的联系。然而，IL-10对脓毒症时心功能抑制的影响，目前鲜有相关文献报道。本课题组前期研究发现，使用低剂量的BLP使脓毒症小鼠免疫耐受后，可明显改善小鼠的心功能，并同时观察到心肌IL-10表达水平较未耐受小鼠增高，提示IL-10可能参与耐受后小鼠心功能的改善。本实验显示:与BLP组比较，不管是IL-10预处理组或是后处理组，IL-10均能够明显减弱BLP诱导的心肌细胞caspase-3的激活以及上调bcl-2/bax的比率，拮抗BLP诱导的心肌细胞凋亡，此种抗凋亡效应可能是IL-10改善感染后心肌抑制的机制之一。

本实验结果表明，BLP能够直接诱导乳鼠心肌细胞凋亡，而IL-10能够拮抗BLP的促凋亡效应。IL-10发挥作用是通过抑制caspase-3蛋白的表达、上调bcl-2/bax比率来抑制心肌细胞的凋亡，对心肌细胞起到保护作用。本文为临床防治感染所致的心功能抑制提供了新的理论及实验依据。

1 Dombrovskiy VY，Martin AA，Sunderram J，et al.Rapid increase in hospitalization and mortality rates for severe sepsis in the United States:a trend analysis from 1993 to 2003〔J〕.Crit Care Med，2007;35(5):1244-50.

2 伍长学，范 英，李 新，等.新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进〔J〕.泸州医学院学报，2009;23(1):1-4.

3 Buerke U，Carter JM，Schlitt A，et al.Apoptosis contributes to septic cardiomyopathy and is improved by simvstain therapy〔J〕.Shock，2008;29(4):497-503.

4 张 倩，周 静，黄 敏，等.芍药苷对细菌脂蛋白诱导的THP-1细胞炎症因子表达的影响〔J〕.江苏医药，2011;37(9):1002-4.

5 Vander-Poll T，Marchant A，Buurman WA，et al.Endogenous IL-10 protects mice from death during septic peritonitis〔J〕.J Immunol，1995;155(11):5397-401.

6 Kaur K，Sharma AK，Singal PK.Significance of changes in TNF-α and IL-10 levels in the progression of heart failure subsequent to myocardial infarction〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006;291(1):106-13.

7 Nishio R，Mataumori A，Shioi T，et al.Treatment of experimental viral myocarditis with interleukin-10〔J〕.Circulation，1999;100(10):1102-8.

8 Stumpf C，Seybold K，Petzi S，et al.Interleukin-10 improves left ventricular function in rats with heart failure subsequent to myocardial infarction〔J〕.Eur J Heart Fail，2008;10(8):733-9.