TLR4基因 T399I多态性通过调节IL－1α和TNF－α表达影响结直肠癌的发生*

戴 穹，钟 丽，张 旭，杨志惠△

(泸州医学院1解剖学教研室，2附属医院肿瘤科，3病理学教研室，四川 泸州 646000)

Toll样受体(Toll－like receptors，TLRs)是一个介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，它通过识别病原相关的分子模式，激活受体后级联反应产生相应的免疫应答[1]。本研究拟探讨TLR4 D299G、T399I和A896G基因多态性与结直肠癌的相关性，并分析其对结肠癌组织中细胞因子蛋白表达的作用。

材料和方法

1 研究人群

268例结直肠癌病人为泸州医学院附属医院肿瘤科及胃肠外科2009～2010年收治并经病理诊断确诊的结直肠癌初诊患者。病理分型均为腺癌。根据TNM分期标准，Ⅰ、Ⅱ期患者共80例，Ⅲ、Ⅳ期患者共188例。另选择同一地区健康体检者268例为对照组。所有研究对象均为无血缘关系汉族个体，2组性别、年龄、吸烟状况等分布均无显著差异。所有研究对象排除心脏、肾脏、肝脏及其它器官系统疾病。每例采血2 mL，EDTA抗凝，－20℃保存，采用酚－氯仿方法提取DNA。部分患者经手术治疗后，10 min内采集肿瘤活体组织标本，生理盐水洗涤后液氮冻存，备用。

2 方法

2.1 基因型检测 分别扩增包含 TLR4 D299G、T399I和A896G多态性位点的基因序列。根据文献[2－3]设计引物。PCR反应体系为25 μL，内含引物、缓冲液、Taq酶和dNTP等，采用Bio－Rad热循环仪。反应条件为95℃预变性4 min，94℃ 45 s、55 s(D299G 和 A896:56 ℃ ;G T399I:58℃)，72 ℃ 1 min，35 个循环，72 ℃ 10 min。D299G，T399I和A896G扩增产物分别为139 bp、406 bp和102 bp，见图1。

Figure1.Results of TLR4 D299G，T399I and A896G amplicons by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1 ～ 4:samples of A896G amplicons;Lane 5～8:samples of D299G amplicons;Lane 9～12:samples of T399I amplicons.图1 TLR4 D299G、T399I和 A896G扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳

D299G、T399I和A896G多态性位点PCR产物10 μL，分别经5 U限制性内切酶BsaB I、Hinf I和Nco I消化，37℃，过夜。酶切产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，见图2～4。

Figure2.TLR4 D299G genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1:GG;Lane 2，3:DG;Lane 4，5:DD;M:marker.图2 TLR4 D299G经聚丙烯酰胺凝胶电泳分型

Figure3.TLR4 T399I genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1，3:TI;Lane 2:II;Lane 4:TT;M:marker.图3 TLR4 T399I经聚丙烯酰胺凝胶电泳分型

Figure4.TLR4 A896G genotyping by polyacrylamide gel electrophoresis.Lane 1:GG;Lane 2，3:AG;Lane 4:AA;M:marker.图4 TLR4 A896G经聚丙烯酰胺凝胶电泳分型

2.2 癌组织细胞因子蛋白浓度检测 选取55例结直肠癌新鲜活体组织标本，其中25名患者携带TLR4 T399I CT或TT基因型，30名患者携带CC基因型，2组性别和年龄无显著差异。

采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)检测肿瘤活体组织匀浆中白细胞介素1α(interleukin 1α，IL －1α)、白细胞介素8(IL －8)、转化生长因子 β(transforming growth factor β ，TGF－ β)和肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)的表达。ELISA试剂盒购自Invitrogen，操作按试剂盒说明书进行。每份样本检测2次，取均值。

3 统计学处理

采用HWE统计学软件进行Hardy－Weinberg平衡检测，采用SPSS 12.0软件包进行t检验、χ2检验、非条件logistic回归模型以及相对危险度近似估计值优势比(odds ratio，OR)估计各研究因素与结直肠癌发病风险的关系。

结 果

1 TLR4基因多态性与结直肠癌相关性分析

病例组和对照组D299G、T399I和A896G多态性基因型分布及与结直肠癌相关性分析见表1。病例组和对照组基因型分布均符合 Hardy－Weinberg平衡定律(P＞0.05)。D299G和A896G多态性基因型及等位基因频率在病例组和对照组中的分布无显著差异。T399I CT合并TT基因型显著增加结直肠癌的患病风险，而携带T399I T等位基因的个体患病风险是C等位基因个体的1.843倍。

2 TLR4基因多态性与结直肠癌临床病理参数分层分析

分层分析结果显示，D299G、T399I和A896G多态性与临床病理分期、肿瘤分化程度无相关性，见表2，且TLR基因多态性与性别、年龄、吸烟状况等无交互作用。

3 TLR4 T399I多态性对结直肠癌组织中细胞因子表达的影响

选取携带T399I CT或TT基因型个体新鲜结直肠癌组织样本25例，携带CC基因型个体组织样本30例，ELISA检测组织匀浆中IL－1α、IL－8、TGF－β和TNF－α细胞因子表达。结果显示，IL－8和TGF－β在不同个体基因型中的表达无显著差异，但携带T399I CT合并TT基因型个体结直肠癌组织中IL－1α和TNF－α浓度显著升高，差异显著，见表3。

表1 TLR4基因多态性基因型分布及与结直肠癌相关性分析Table1.Frequency distribution of TLR4 polymorphisms between cases and controls and their associations with CRC

讨 论

本研究应用 PCR－RFLP技术探讨 TLR4基因 TLR4 D299G，T399I和A896G多态性与大肠腺癌的关系，以探索疾病的遗传易感性及机制。CT合并TT基因型显著增加结直肠癌的患病风险，而携带T399I T等位基因的个体患病风险是C等位基因个体的1.843倍，并且携带T399I CT合并TT基因型个体结直肠癌组织中IL－1α和TNF－α浓度显著升高。

有研究显示，TLR4在正常肠道上皮表达量很低，但在炎症性肠病患者的肠黏膜上皮却高表达，并且在结肠癌组织中的表达显著高于正常对照组[4]。研究显示，LPS可激活TLR4信号途径，诱导IL－6等分泌，使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞的攻击产生抵抗，另外LPS刺激的肿瘤细胞上清液可抑制T细胞增殖和NK细胞杀伤活性[5－6]，致肿瘤逃避免疫攻击。虽然大肠癌与细菌感染等环境因素有关，但其发生最终取决于个人对肿瘤的易感性。本研究结果显示，携带TLR4 T399I T等位基因的个体患大肠癌的风险显著增加，并且这些个体肿瘤组织中IL－1α和TNF－α表达升高。推测由于个体基因型不同，导致个体对细菌等环境因素反应性不同，TLR4受体后信号途径被激活后，调节细胞因子的表达，促进结直肠癌的发生。

表2 TLR4多态性与结直肠癌临床病理参数分层分析Table2.The association of clinicopathological parameters of CRC and TLR4 polymorphisms

表3 TLR4 T399I多态性不同基因型个体结直肠癌肿瘤组织匀浆中细胞因子的浓度Table3.Concentratons of the cytokines in biopsies of CRC patients with TLR4 T399I polymorphism(ng/L..n=55)

表3 TLR4 T399I多态性不同基因型个体结直肠癌肿瘤组织匀浆中细胞因子的浓度Table3.Concentratons of the cytokines in biopsies of CRC patients with TLR4 T399I polymorphism(ng/L..n=55)

＊＊P ＜0.05 vs CC genotype.

Genotype IL－1α TNF－α IL－8 TGF－β CT+TT 34.52±8.97* 40.32±8.95*88.16±4.63 38.57 ±7.75 CC 20.93±6.22 24.30±5.87 85.37±8.74 41.25 ±8.02

[1]Santini D，Angeletti S，Ruzzo A，et al.Toll－like receptor 4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms in gastric cancer of intestinal and diffuse histotypes[J].Clin Exp Immunol，2008，154(3):360 －364.

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[3]Lammers KM，Ouburg S，Morré SA，et al.Combined carriership of TLR9－1237C and CD14－260T alleles enhances the risk of developing chronic relapsing pouchitis[J].World J Gastroenterol，2005，11(46):7323 －7329.

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