烟草NtRAX基因的克隆和序列分析

高晓明，张泽坤，王卫锋，刘贯山，李凤霞，崔萌萌，孙玉合*

（1.农业部烟草生物学与加工重点实验室，中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.青岛农业大学，青岛 266109）

烟株上腋芽的存在，会消耗大量养分，严重影响烟叶的产量和品质[1]。烟草中，已经获得与腋芽分生组织形成相关基因NtLS，该基因与拟南芥中控制腋芽分生组织形成的LAS基因高度相似[2]，对该基因进行 RNA干扰研究，所获得的转基因烟草植株，在腋芽的发生方面与野生型相比没有明显的区别[3]。LAS和RAX是两条相对独立的调控途径，但是在功能上可能存在互补[4-5]。拟南芥中，现已发现RAX1、RAX2、RAX3基因，同属于MYB基因家族。MYB基因家族是植物最大的转录因子家族之一，现有研究表明，植物MYB转录因子在植物器官形成、植物叶片的形态建成及抗病中起重要作用[6]，其途径之一包括调节腋芽分生组织的形成[7]。拟南芥中，RAX基因控制腋芽分生组织形成的非常早期的一步。RAX突变株沿茎轴侧芽形成有缺陷。RAX基因在功能上的冗余，对拟南芥次生轴的形成产生微调。其中，RAX1、RAX3基因在腋芽中心组织表达量较高[8]。

本研究通过在GenBank中寻找拟南芥RAX基因相关序列，通过同源比对，采用RACE技术，克隆获得普通烟草中与RAX基因高度相似的基因，目的是为研究该基因的功能奠定基础，进而为通过分子手段解决烟草腋芽问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为K326。2010年冬，在温室内播种，自然光照条件下生长至营养生长期。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取和检测 取烟草K326幼嫩叶片为材料，Trizol法提取幼嫩叶片的总RNA。1×TBE缓冲液，1%琼脂糖凝胶，电泳检测总RNA。

1.2.2 反转录获得cDNA 以总RNA为模板，按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit的说明书进行。

1.2.3NtRAX中间片段的获得 以 NCBI的拟南芥AtRAX2基因的序列（NM_129245.2）为信息探针，在烟草EST数据库中进行Blastp检索，获得若干与之同源性较高的蛋白质序列。选取与e值最低的蛋白质序列对应的核酸序列（471 bp）为参照，设计引物，RAX-1：GAAGACAGAGTCATTTGTAGCC；RAX-2：ATTTGGAGTAGAGGGGAAG，以cDNA模板，进行PCR扩增，对400 bp附近的条带回收并测序。

1.2.4NtRAX末端 cDNA第一链的合成 3′RACE和5′末端第一链cDNA的合成，分别以提取的RNA为模板，按照Invitrogen的Generacer试剂盒说明书进行。

1.2.5 3′末端片段的扩增 用已经获得并测序验证的404 bp大小的中间片段为模板链，设计2条末端扩增引物：

3race-GSP1：CCAGTTACCAGGCAGGACAGACAATG；

3race-GSP2：TGAAGGCGGAGGAAAGCCAATGAATG；

按照Generacer试剂盒说明书配制PCR扩增体系。反应程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5个循环；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5个循环；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5个循环；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2min，5 个循环；72 ℃，10 min，4 ℃，HOLD。

1.2.6 5′末端片段的扩增 用已经获得并测序验证的404 bp大小的中间片段为模板链，设计2条末端扩增引物：

5race-GSP1：TCATTGTCTGTCCTGCCTGGTAACTGG；

5race-GSP2：CCATTTCCATTCATTGGCTTTCCTCCG；

按照Generacer试剂盒说明书配制PCR扩增体系。反应程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 个循环；94 ℃，30 s，66 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 个循环；94 ℃，30 s，64 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 个循环；94 ℃，30 s，62 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5 个循环；72 ℃，10 min，4℃，HOLD。

1.2.7 PCR产物的回收、连接及测序 1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切胶，按照康为世纪琼脂糖凝胶产物回收试剂盒说明书进行凝胶回收。将回收产物与pMD18-T载体连接，转化TOP10E.coil感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取白斑进行菌落PCR鉴定后，选择阳性克隆摇菌并测序。

1.3 序列分析

采用 ContingExpress软件进行序列的拼接组装；NCBI的ORF finder预测开放阅读框；用NCBI的BLASTn序列比对工具进行同源性比对；蛋白质的等电点和分子量计算，采用 ExPASy网站的Compute PI/Mw tool；Pfam在线(http://pfam.sanger.ac.uk/)进行序列保守功能区的分析；采用 Clustalx软件进行多序列比对；以序列比对的结果为基础，利用MEGA5.0软件构建系统进化树。

2 结 果

2.1 NtRAX中间片段的获得

以cDNA为模板，RAX-1和RAX-2为引物，扩增获得一条 400 bp附近片段。经测序验证，共404 bp。

2.2 NtRAX全长基因的获得

通过3′末端扩增，获得了723 bp的3′末端，该末端有24个碱基的PolyA尾巴，表明获得了完整的3′端编码序列。通过5′末端扩增，获得了407 bp的5′末端，在起始密码子ATG 42 bp前有一个终止密码子TAG，表明获得了完整的5′端编码序列。

2.3 NtRAX基因的序列分析

使用contingExpress软件对382 bp的5′RACE序列、418 bp的3′RACE序列和404 bp的中间序列进行拼接，获得长度为1112 bp的全长基因cDNA序列。该序列全长 1112 bp，含有 429个腺嘌呤（38.6%）、179个胞嘧啶（16.1%）、293个鸟嘌呤（19.0%）、293个胸腺嘧啶（26.3%）。

对该序列进行ORF分析，得出该序列5′端非编码区长度为96 bp，编码区长度为954 bp，3′端非编码区长度为62 bp，其中编码区编码317个氨基酸（图1）。将该基因命名为NtRAX（NCBI登录号为JQ228591）。

图1 NtRAX的cDNA和蛋白质全长序列Fig.1 Full-length sequences of NtRAX cDNA and protein

将获得的NtRAX基因的 cDNA序列在 NCBI上进行 BLAST分析，发现该序列与已有的番茄cDNA文库中的单个克隆（LEFL1032AE06）部分序列相似性为74%，E值为0.0；与拟南芥RAX2基因的序列（NM_129245）相似性为 80%，E值为9e-86。

用ExPASy网站的Compute PI/Mw tool分析得到NtRAX基因所编码的蛋白质的等电点为7.02，分子量为35.42 KDa。在线进行保守区域分析，结果表明，该蛋白在N端分别含有由52个和49个氨基酸组成的两个MYB结构域，并且每个结构域含有典型的MYB转录因子所特有的保守的色氨酸残基W（图2），说明所克隆的NtRAX基因是MYB基因家族成员。

图2 NtRAX的保守结构域Fig.2 Conserved domains of NtRAX

采用 Clustalx软件对来自拟南芥的AtRAX1、AtRAX2、AtRAX3，来自大豆的GmMYB12a、GmMYB12B2、GmMYBJ6、GmMYBJ7、GmMYBZ1、GmMYBZ2，来自杨树的PeMYBF1、PeMYBL1进行多序列比对（图3）。由图3分析，NtRAX蛋白功能与AtRAX具有较高同源性，推测NtRAX具有调节腋芽分生组织形成功能。采用MEGA5软件分析绘制系统进化树（图4）。由进化树可以看出，NtRAX和GmMYBJ7的进化关系最近，推测NtRAX是具有转录激活活性的MYB家族基因。

3 讨 论

MYB类转录因子以保守的MYB结构域为共同特征。MYB结构域是一段约51～53个氨基酸的肽段，每个结构域含有3个保守的色氨酸残基(W)[9]，分别被18～19个氨基酸残基隔开，折叠成螺旋－转角－螺旋结构，组成1个疏水核心。按照含有的MYB结构域的数量，MYB转录因子可分成 R1、R2R3、R1R2R3三个家族[9]。MYB转录因子主要参与生物的生长、发育和抗胁迫等方面的调节[10]。绝大多数MYB转录因子在植物代谢调控中起转录激活作用，也有少量起转录抑制作用[11-13]。

图3 NtRAX蛋白与其他MYB蛋白多重比对Fig.3 Multi-alignment of NtRAX and other MYB proteins

图4 烟草、拟南芥、大豆、杨树的部分MYB基因系统进化树Fig.4 A phylogenetic tree of MYB gene from Nicotiana tabacum, Arabidopsis, Glycine max and Populus euramericana

本研究克隆获得了NtRAX基因，对新基因功能的预测，主要是通过同源比对，利用同源基因的功能来推测，得出NtRAX基因是具有转录激活活性的烟草腋芽分生组织形成的调控基因。该基因的功能，还应在后续试验中不断验证。

本试验中烟草品种选择了作为常规对照的品种 K326，所取组织为幼嫩叶片。从研究腋芽基因的角度考虑，有以下想法，可在将来的试验中进一步研究：（1）选择腋芽多发的烟草品种。不同品种的烟草有其独特的生物学表现，腋芽多发品种中相关基因的存在与表达情况是否与常规品种一致。（2）选择烟草植株不同组织，研究相关基因在不同组织的表达情况。（3）对烟草植株进行打顶处理，研究打顶前和打顶后不同组织相关基因的表达情况。

4 结 论

本研究运用RACE方法克隆得到了烟草腋芽基因NtRAX，NCBI登录号为JQ228591，该基因全长1112 bp，编码区954 bp，编码317个氨基酸，同源性分析表明，NtRAX属于MYB基因家族。MYB家族蛋白是一类转录因子，因此，NtRAX基因编码的产物可能通过与相关的转录调节因子结合，激活和促进腋芽的生长。NtRAX基因的克隆，为进一步研究烟草腋芽，从分子角度对腋芽的发生进行干扰奠定了基础。

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