甘氨酸对高果糖饮食诱导的大鼠胰岛素抵抗及认知功能损害的影响*

吴惠文，韩德五，许瑞龄，周 鑫，王 锋，赵元昌

(山西医科大学肝病研究所，基础医学院病理生理教研室，山西 太原 030001)

过多果糖(fructose，Fru)摄入引起肥胖、高血压、血脂代谢异常、2 型糖尿病等代谢性疾病［1－3］。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)作为诸多代谢性疾病发病的“共同土壤”，与认知功能损害或阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)关系密切［4－5］。甚至有学者提出AD本身就是“脑的胰岛素抵抗状态”或“3型糖尿病”的观点［6］。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是体内触发免疫反应、调节炎症级联反应最重要的因素，可参与多种代谢性疾病的发生、发展［7］。我室长期致力于研究肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia，IETM)在疾病损伤中的作用，并发现甘氨酸(glycine，Gly)可减轻多种肝损伤导致的IETM［8－9］。为此，我们拟观测甘氨酸是否可通过减轻IETM改善高果糖饮食诱导的IR和认知功能损害。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)和总胆固醇(total cholesterol，TC)试剂盒购自中生北控公司;胰岛素、TNF－α、IL－6 ELISA试剂盒购自R＆D;LPS试剂盒购自厦门鲎试剂实验厂;游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)试剂盒购自南京建成公司;胰岛素受体β亚单位(insulin receptor β subunit，IRβ)、磷脂酰肌醇3－ 激酶 α 亚单位(phosphatidylinositol 3 － kinase α subunit，PI3Kα)抗体购自 Cell Signaling Technology;磷酸化的IRβTyr1162/1163和 PI3KαTyr508抗体购自 Santa Cruz。

1.2 动物 清洁级雄性SD大鼠32只，体重230～240 g，购自山西医科大学动物中心。

2 动物分组及处理

大鼠随机分为4组，每组8只;对照组(control)，饮用自来水;果糖模型组(Fru组)，饮用含8% 果糖的自来水;干预组(Fru+Gly组)，饮用含8%果糖+1% 甘氨酸的自来水;甘氨酸组(Gly组)，饮用含1% 甘氨酸的自来水。大鼠自由饮水、进食(标准大鼠饲料)，每月测量体重及收缩压。8个月末，在结束口服糖耐量试验及认知功能测试后，12 h禁食，1%戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血并分离血浆，迅速分离大脑皮层，－80℃冷冻保存。

3 检测指标和方法

3.1 血浆指标检测 按试剂盒说明书分别测定血浆葡萄糖、TG、HDL － C、TC、FFA、胰岛素、LPS。计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of IR，HOMA－IR)，公式为:空腹血糖 (mmol/L)×空腹胰岛素 (103EU/L)/22.5。

3.2 口服糖耐量试验 12 h禁食，以50%的葡萄糖溶液灌胃(1.5 g/kg)，分别于灌胃前(0 min)、灌胃后(15 min、30 min、120 min)尾静脉采血，采用血糖仪(罗氏活力型)检测血糖。

3.3 促炎因子检测 血浆及脑组织(10%脑皮层匀浆)TNF－α和IL－6的检测采用ELISA试剂盒并按照说明书操作进行。

3.4 Western blotting检测 IRβ、PI3Kα 及其磷酸化蛋白表达 取冻存皮层组织，分别置于玻璃匀浆器中加入1 mL组织裂解液在冰浴中反复研磨，裂解30 min，4℃ 12000 r/min离心20 min，取上清液 BCA法定量，调整各上样量 40 μL/well，7.5%SDS 聚丙乙烯酰胺凝电泳，4℃ PVDF转膜过夜，5%(W/V)脱脂奶粉室温封闭3 h，分别与目的抗体(IRβ和PI3Kα 抗体，1∶1000 稀释;磷酸化蛋白抗体，1∶750稀释)4℃杂交过夜，洗涤后，加入辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗，室温孵育2 h，洗涤、曝光、显影，采用Quantity One(Bio－Rad Laboratories)对胶片进行灰度分析。

3.5 Morris水迷宫测试认知功能 Morris水迷宫系统由水迷宫装置、图像采集处理系统(Ethovision 3.0)组成。测试用的圆形水池直径150 cm，高30 cm，由内部涂抹成黑色油漆的不锈钢材料制作而成。水池内水的高度30 cm，水温保持在24～26℃。黑色的逃避平台直径14 cm，低于水面1.5 cm并放置于水池其中一个象限的中央。摄像机位于水池上方，记录大鼠游泳轨迹与时间。Morris水迷宫实验由3部分组成。其中，平台逃避实验连续持续5 d，每天上午、下午各进行2次。每次实验将大鼠面对池壁放入水池任何一象限中央，让其自由游泳寻找平台。当大鼠爬上平台时，让其在平台停留20 s，再进行下次实验。如果在120 s内，大鼠没有找到平台，则用手指引大鼠爬上平台，仍然让其在平台上停留20 s。实验中，大鼠到达平台的时间即为逃避潜伏期(escape latency)。空间探索实验在平台逃避实验结束后第6 d进行。实验前，移去水池内平台，用相同方法置大鼠与水池中，120 s内让大鼠自由游泳寻找平台，以测试大鼠空间记忆效果，主要记录大鼠在水池内不同象限游泳所花费的时间与距离。最后，实验主要测试大鼠游泳速度及视力水平。实验前，平台仍被放置到水池原先位置并高于水面1.5 cm，重复平台逃避实验3次，主要记录逃避潜伏期与游泳速度。

4 统计学处理

结 果

1 大鼠一般状况

实验期间，所有大鼠状况良好。模型组大鼠体重增长在第3～6月明显高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)，甘氨酸在第4月、第6月显著降低模型组体重增长(P＜0.05)，见图1A。模型组与对照组比较，第3月后收缩压明显升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，甘氨酸在第4～6月显著降低模型组收缩压的升高(P＜0.05，P ＜0.01)，见图1B。

2 血糖、血脂代谢变化

与对照组比较，模型组血糖、TG、TC、HDL－C和FFA水平显著升高(P＜0.01);干预组与模型组比较，血糖、TG及 FFA 显著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，但TC和HDL－C变化无显著差异，见表1。

Figure 1.Effects of glycine(Gly)on monthly body weight gain and systolic blood pressure in high－fructose(Fru)diet rats.E.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.图1 甘氨酸对高果糖饮食大鼠每月体重增长与收缩压变化的影响

表1 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血糖及血脂的影响Table 1.Effects of glycine on plasma glucose and lipid profiles in high－fructose diet rats(mmol/L.E.n=8)

表1 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血糖及血脂的影响Table 1.Effects of glycine on plasma glucose and lipid profiles in high－fructose diet rats(mmol/L.E.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.

Group Glucose TG TC HDL－C FFA Control 4.58 ±0.24 0.31 ±0.02 1.16 ±0.07 1.26 ±0.05 0.39 ±0.04 Fru 8.84 ±0.52＊＊ 0.44 ±0.04＊＊ 1.77 ±0.10＊＊ 0.88 ±0.07＊＊ 0.85 ±0.03＊＊Fru+Gly 7.60 ±0.34# 0.34 ±0.02## 1.70 ±0.03 0.85 ±0.04 0.51 ±0.06##Gly 4.51 ±0.20 0.30 ±0.02 1.07 ±0.04 1.06 ±0.050.35 ±0.02

3 糖耐量实验结果

甘氨酸组各时点血糖与对照组比较，没有显著差异;模型组各时点血糖显著高于对照组(P＜0.01);与模型组比较，干预组各时点血糖显著降低(P＜0.05，P ＜0.01)，见图2。

4 血浆胰岛素、LPS与HOMA－IR变化

模型组血浆胰岛素、LPS及HOMA－IR显著高于对照组(P＜0.01);干预组上述指标显著低于模型组(P ＜0.01)，见表2。

5 血浆LPS与HOMA－IR及FFA的相关性

血浆 LPS与 HOMA －IR(rs=0.75，P ＜0.01)及FFA(rs=0.62，P ＜0.01)呈显著正相关。

6 血浆及脑组织TNF－α、IL－6变化

模型组血浆及脑组织TNF－α、IL－6水平明显高于对照组(P＜0.01);干预组与模型组比较，上述指标明显降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，见表3。

7 Western bloting结果

模型组皮层IRβ表达与对照组相比大约升高了2倍(P ＜0.01)，但 p－IRβTyr1162/1163/IRβ 及 p－PI3KαTyr508/PI3Kα比值则显著降低(P＜0.01);甘氨酸显著降低模型组IRβ的表达(P＜0.05)，显著提高2种蛋白表达的比值(P＜0.01);对照组与甘氨酸组蛋白表达无显著差异，见图3A、B。

Figure 2.Effects of glycine on oral glucose tolerance test in high－fructose diet rats.E.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.图2 甘氨酸对高果糖饮食大鼠口服糖耐量试验的影响

表2 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血浆胰岛素、LPS及HOMA－IR的影响Table 2.Effects of glycine on plasma insulin，LPS and HOMA －IR in high－fructose diet rats(E.n=8)

表2 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血浆胰岛素、LPS及HOMA－IR的影响Table 2.Effects of glycine on plasma insulin，LPS and HOMA －IR in high－fructose diet rats(E.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Fru group.

Group Insulin(mU/L) Endotoxin(103EU/L)HOMA－IR Control 23.67±1.04 0.07±0.01 4.79±0.26 Fru 43.99±1.33＊＊ 0.17±0.02＊＊ 16.74±1.07＊＊Fru+Gly 37.70±1.65## 0.11±0.01## 13.37±0.57##Gly 22.66±0.89 0.07±0.01 4.56±0.31

表3 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血浆及脑组织促炎因子的影响Table 3.Effects of glycine on pro－inflammatory cytokines in plasma and brain tissues in high－fructose diet rats(E.n=8)

表3 甘氨酸对高果糖饮食大鼠血浆及脑组织促炎因子的影响Table 3.Effects of glycine on pro－inflammatory cytokines in plasma and brain tissues in high－fructose diet rats(E.n=8)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs Fru group.

Plasma Brain tissue TNF－α(μg/L)IL－6(ng/L)TNF－α (μg/L) IL－6(ng/L)Control 1.17±0.06 30.97±1.93 3.50±0.15 70.8 Group 438±5.65 Fru 1.74±0.06＊＊ 50.64±0.04＊＊ 4.78±0.20＊＊ 104.96±7.50＊＊Fru+Gly 1.46±0.05## 43.04±1.45# 4.18±0.20# 86.11±4.53##Gly 1.11±0.05 30.26±0.76 3.41±0.14 76.20±3.

8 Morris水迷宫结果

随着测试天数的增加，大鼠平均逃避潜伏期从93.49 s下降到 26.95 s。在测试的第 1 d，4 组大鼠平均逃避潜伏期没有统计学差异;从第2 d起，模型组平均逃避潜伏期明显长于对照组(P＜0.01);干预组与模型组比较，第4 d、5 d平均逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05);对照组和甘氨酸组平均逃避潜伏期无统计学差异，见图4A、B。空间探索实验结果显示，模型组在目标象限所占时间与总时间的百分比显著低于对照组(P＜0.01);干预组与模型组比较，该百分比显著升高(P＜0.05);对照组和甘氨酸组无显著差异，见图4C。测试大鼠游泳速度及视力实验结果表明，各组大鼠游泳速度(约14.5 cm/s)和可见平台逃避潜伏期(约14.2 s)无显著差异。

讨 论

食物中普遍添加蔗糖及果糖，是现代社会饮食的一个特点。大量研究表明，果糖过多摄入可引起肥胖、高血压、2 型糖尿病等代谢性疾病［1－3］。IR 作为代谢综合征(metabolic syndrome，MS)发病的共同病理机制参与了多种代谢性疾病的发生。本实验通过长期(8个月)高果糖饮食喂养诱导大鼠发生与人类相似的MS，如肥胖、高血压、血脂代谢紊乱、糖耐量异常、HOMA－IR升高等。果糖吸收后，经门脉进入肝脏，其代谢可绕过糖酵解限速酶－磷酸果糖激酶的调控，在果糖激酶作用下迅速转为1－磷酸果糖，后者经糖酵解或糖异生途径进一步转化为葡萄糖、糖原及TG。故高果糖饮食可引起肝脏TG聚集和FFA生成增加，引起肝脏对胰岛素敏感性下降和高胰岛素血症形成。

近年来研究表明，MS往往伴有全身轻度炎症反应，提示这种慢性亚临床炎症可能参与MS发病［10］。LPS是促发炎症级联反应最重要的因子，其结合Toll样受体4(Toll－like receptor 4，TLR4)受体通过IKK/NF－кB通路可导致促炎因子释放。多种肝损伤模型均伴有IETM，其通过启动炎症机制参与多种肝病的发生、发展［8－9，11］。Cani等［7］研究也证实，高脂饮食伴有的代谢性内毒素血症可启动大鼠发生肥胖及糖尿病。而敲除了TLR4基因可有效保护NF－κB介导的炎症和IR［12］。甘氨酸是机体一种非必需氨基酸，可降低多种肝损伤所伴的IETM［8－9］。本实验结果显示，长期高果糖饮食诱导大鼠发生MS时伴有IETM、轻度炎症及IR;甘氨酸能减轻模型组IETM、炎症及IR，并改善MS(如肥胖、高血压、血脂异常等)。本实验大鼠血浆LPS水平与IR高度相关提示，IETM可能是果糖饮食致外周IR发生的重要因素。LPS引起外周IR可能涉及的机制有:(1)LPS与TLR4受体结合通过IKK/NF－κB通路，释放大量的促炎因子(TNF－α、IL－6等)引起胰岛素受体底物酪氨酸磷酸化，诱发IR。(2)LPS可直接刺激脂肪分解为FFA，其通过TLR4受体介导，引起脂肪细胞、巨噬细胞及肝脏枯否细胞释放促炎因子，促发胰岛素信号转导异常，引起IR［12－13］。本实验结果也显示，模型组大鼠血浆FFA水平显著升高，并且与血浆LPS水平正相关。(3)LPS还可通过激活巨噬细胞产生活性氧自由基参与IR的发生［14］。

Figure 3.Effects of glycine on the expression of IRβ，p－IRβTyr1162/1163，PI3K α and p－PI3KαTyr508in the cerebral cortex in highfructose diet rats.A:relative densitometric values of IRβ/β－actin(left panel)and p－IRβTyr1162/1163/IRβ (right panel);B:relative densitometric values of PI3Kα/β－actin(left panel)and p－PI3KαTyr508/PI3Kα(right panel).E.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.图3 甘氨酸对高果糖饮食大鼠大脑皮层IRβ、p－IRβTyr1162/1163、PI3Kα及p－PI3KαTyr508蛋白表达的影响

Figure 4.Effects of glycine on the results of Morris water maze test in high－fructose diet rats.A:the results of the escape latency test in different groups;B:original swimming traces of the rats in different groups in the hidden platform acquisition on the 4th day;C:the percentage of time spent in the target quadrant in different groups.E.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs Fru group.图4 甘氨酸对高果糖饮食大鼠Morris水迷宫实验的影响

越来越多研究资料表明，MS与认知功能损害或者 AD 关系密切［4－5］。Yaffe 等［4］对 2632 名 MS 患者调查结果表明，MS是认知功能下降的高危险因素。近年来研究认为，胰岛素信号转导在调节脑内糖代谢中发挥重要作用，进而对神经发育和学习、记忆产生影响［15］。Ho 等［16］发现，高脂饮食可诱导小鼠发生中枢IR，其与学习、记忆功能损害密切相关。本研究显示，长期高果糖饮食既引起大鼠发生MS，也引起认知功能发生损害。尽管MS与认知功能损害之间的机制尚未完全阐明，但普遍认为IR发挥着重要作用。IRβ和PI3K是胰岛素信号转导关键蛋白，其功能减弱是形成IR的重要分子基础。本研究发现，长期高果糖饮食不仅诱导大鼠发生外周IR和炎症反应，同时中枢也出现明显的 IR(p－IRβTyr1162/1163/IRβ 和 p －PI3KαTyr508/PI3Kα 比值降低)和炎症反应;甘氨酸通过降低IETM可改善模型组中枢IR、炎症和认知功能。以上结果提示，中枢IR及炎症在模型组大鼠认知功能障碍发生中可能起关键作用。模型组大鼠发生中枢IR或认知功能损害可能的原因有:(1)外周炎症因子通过活化脑血管内皮细胞进入脑内，可引起中枢炎症反应，进而影响认知功能［17］。本实验也发现，甘氨酸通过降低IETM可显著降低外周与中枢的促炎因子水平。(2)慢性高胰岛素血症通过下调血脑屏障胰岛素受体，减少胰岛素转运进入脑，也可促进中枢 IR的发生［18］。(3)外周少量LPS在其受体介导下可进入脑，进而激活小胶质细胞释放促炎因子，促进中枢 IR的发生［19－20］。在实验中我们还发现，甘氨酸对高果糖饮食诱导的早期血压升高具有改善作用(待发表)。

综上所述，在长期高果糖饮食诱导大鼠发生外周及中枢IR中IETM发挥着重要作用。甘氨酸通过降低IETM可减轻外周与中枢炎症和IR，进而改善高果糖饮食诱导的MS和认知功能障碍。

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