坛紫菜蛋白肽的酶法制备及工艺优化

陈新峰，张治国，王君虹，周利亘，戴志远

(1.浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江杭州310021;2.浙江工商大学水产品加工研究所浙江杭州310012)

紫菜富含蛋白质、多糖、脂类、维生素和矿物质等多种成分，通常干紫菜中含蛋白质25%～50%，碳水化合物20%～40%，脂肪1%～3%，灰分7.8%～26.9%，以及大量维生素等[1]。以紫菜蛋白为原料制备的紫菜蛋白肽具有降血压[2]、抗菌[3]、抗氧化[4]等多种生理活性功能，日益受到人们的广泛关注，成为紫菜高值化开发利用的研究热点。

浙江是紫菜养殖大省，养殖品种以坛紫菜为主，坛紫菜产量较大，但精深加工率较低，目前大多停留在以烘干为主的初级加工阶段，其经济附加值较低。以坛紫菜为原料制备坛紫菜蛋白肽是坛紫菜精深加工高值化利用的有效途径。本研究以坛紫菜蛋白为原料，采用生物酶法制备坛紫菜蛋白肽，优化酶解工艺参数，并通过体外实验验证其部分生物活性，为坛紫菜的高值化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

坛紫菜蛋白，实验室自制;3.7万U·g－1菠萝蛋白酶、99.0万U·g－1木瓜蛋白酶，上海海洋生物技术有限公司产品;197.6万U·g－1中性蛋白酶，上海如吉生物科技发展有限公司产品;8.7万U·g－1碱性蛋白酶，诺维信公司产品;127.4万U·g－1胃蛋白酶、261.3万U·g－1胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司产品;血管紧张素转换酶(ACE)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)，Sigma公司产品;总胆固醇试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司产品。其他化学试剂均为国产分析纯。

DK-8D型恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司产品;LXJ-HB型离心机，上海安亭科学仪器厂产品;ALB-224型电子天平、PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器有限公司产品;UV-1800紫外分光光度计，岛津仪器(苏州)有限公司产品。

1.2 方法

坛紫菜蛋白肽制备。将坛紫菜蛋白配制成一定质量分数的溶液，调整pH、温度，添加蛋白酶，水解一定时间后，95℃水浴灭酶10 min，4 000 r·min－1离心分离10 min，收集上清液，即为坛紫菜蛋白肽溶液。

1.2.1 商品蛋白酶筛选试验

对菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶在各自的最适条件下，对坛紫菜蛋白进行酶解，以水解度为指标，筛选酶解效果最好的蛋白酶。

1.2.2 单因素试验

以胰蛋白酶为坛紫菜蛋白酶解酶，分别以酶比底物[E/S]值，pH值，温度，时间为试验因素，选择最佳试验条件。

1.2.3 酶解工艺优化试验

以[E/S]值、pH值、酶解时间和酶解温度为试验因素，利用L9(34)正交表对胰蛋白酶酶解坛紫菜蛋白工艺参数进行优化研究。

1.2.4 测定项目及方法

蛋白质测定采用GB/T 5009.5—2003的方法。

2018年1月24日国务院办公厅印发《关于改革完善全科医生培养与使用激励机制的意见》(下称《意见》)，[17]该意见指出，到2020年，城乡每万名居民拥有2～3名合格的全科医生。足见全科医生在未来几年间的重要性。

水解度测定采用甲醛滴定法[5]。

降血压活性测定。采用ACE(血管紧张素转化酶)活性抑制率为评判指标，方法参照文献[6]。

ACE活性的抑制率%=

式中D228为228 nm处测得的吸光值。

降胆固醇活性测定。采用胆固醇在模拟胆汁胶束溶液中的溶解度抑制率为评判指标进行测定，方法参照文献[7]。

式中:A空白溶液的胆固醇溶解度;B样品溶液的胆固醇溶解度。

抗氧化活性测定。采用羟自由基清除率为评判指标进行测定，方法参照文献[8]。

式中:D0为空白对照;Di为肽类提取液的吸光值;Dj为无水杨酸时肽类提取液的吸光值。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

图1 不同蛋白酶的酶解效果

从图1可以看出，在供试的6种商品蛋白酶中，胰蛋白酶的酶解效果明显优于其他5种蛋白酶，因此试验选取胰蛋白酶水解坛紫菜蛋白。

2.2 单因素试验

2.2.1 酶比底物[E/S]值

在pH值7.0、温度45℃条件下，分别用不同的[E/S]值酶解5 h，比较E/S对水解度的影响，结果见图2。

图2 E/S值对水解度的影响

从图2看出，在坛紫菜蛋白酶解过程中，在酶用量确定的情况下，起始DH随E/S值升高而升高，当E/S值达到到0.045/3后，DH总体呈平稳态势，因此E/S值选择为0.045/3较为适宜。

2.2.2 pH值

在[E/S]值0.045/3、温度45℃条件下，调节不同pH值，分别酶解5 h，然后测定水解度，考察pH值对水解度的影响，结果见图3。

图3 pH值对水解度的影响

从图3看出，起始水解度随pH值的升高而提升，当pH值达到8时水解度达最高，而后水解度呈快速下降趋势。认为胰蛋白酶在弱碱性条件下酶活力最强，强酸或强碱环境可能造成胰蛋白酶的变性从而降低了胰蛋白酶的活力，因此，选择pH值为8较为适宜。

2.2.3 温度

在[E/S]值0.045/3、pH值8，设置不同的温度条件，分别酶解5 h，测定水解度，考察温度对水解度的影响，结果见图4。

从图4看出，在胰蛋白酶酶解坛紫菜蛋白的过程中，起始水解度随温度的升高而升高，当达到45℃后，水解度总体呈下降趋势，且保持基本稳定，因此，酶解温度选择45℃较为适宜。

图4 温度对水解度的影响

2.2.4 时间

在[E/S]值0.045/3，pH值8，温度45℃条件下，进行不同时间酶解，测定水解度，考察酶解时间对水解度的影响，结果见图5。

图5 酶解时间对水解度的影响

从图5看出，胰蛋白酶酶解坛紫菜蛋白的水解度随着时间的延长而升高，当时间达到4 h后，增加趋势趋于缓慢，且几乎保持不变，因此，酶解时间选择4 h较为适宜。

2.3 酶解工艺优化

[E/S]值、pH值、酶解温度和酶解时间4因素3水平对胰蛋白酶水解坛紫菜蛋白的正交试验结果见表1。由表1看出，影响胰蛋白酶酶解坛紫菜蛋白水解度的效果主次顺序为:酶解温度＞[E/S]值＞酶解时间＞pH值;其优化工艺参数为:C3A3D3B2，即温度53℃，[E/S]值0.07/3.5，酶解时间4.5 h，pH值7.5。经验证试验得到其水解度达到85.13%，大于正交试验表中任一组合。

2.4 坛紫菜蛋白肽生物活性

经最优工艺酶解得到的坛紫菜蛋白肽溶液，经超滤分离，取一定量的坛紫菜蛋白肽溶液，测定其体外降血压活性、降胆固醇活性和抗氧化活性。结果40μL坛紫菜蛋白酶解液的ACE抑制率为87.5%;5 mL坛紫菜蛋白酶解液的胆固醇胶束溶解度抑制率(降胆固醇活性)为69.09%;4 mL坛紫菜蛋白酶解液的羟自由基清除率(抗氧化活性)为38.32%。

表1 胰蛋白酶酶解坛紫菜工艺优化结果

3 小结

以水解度为指标，对6种商品蛋白酶进行筛选，结果胰蛋白酶水解坛紫菜蛋白效果最佳。通过正交试验确定，胰蛋白酶水解坛紫菜蛋白的最优工艺参数为[E/S]值0.07/3.5，pH值7.5，温度53℃，酶解时间4.5 h，其水解度达到85.13%。

通过体外实验验证，经最优工艺酶解得到的坛紫菜蛋白肽具有良好的降血压活性(87.5%)、降胆固醇活性(69.09%)和抗氧化活性(38.32%)。其最小作用计量和IC50将在后续实验作进一步研究。

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[5]吴谋成.食品分析与感官评价[M].北京:中国农业出版社，2002:77－78.

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