响应面法优化达托霉素发酵培养基的研究

宇光海，尹艳丽，张 垚

(河南工业大学生物工程学院生物工程系,河南 郑州 450001)

达托霉素(DAP)属于A21978C家族，是一种含有13个氨基酸的大环脂肽类抗生素，在玫瑰孢链霉菌中以非核糖体蛋白合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)机制合成，具有依赖于Ca2+破坏病菌细胞膜的新型作用，因此对许多耐药病菌具有显著的治疗作用[1～4]。达托霉素具有在体外抗绝大多数临床革兰氏阳性菌的作用，对于一些可选择的抗生素很少的耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、糖肽类敏感的金黄色葡萄球菌(GISA)、凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)等的感染具有有效的杀菌和抑菌效果[5]。达托霉素2003年被FDA批准用来治疗由革兰氏阳性菌引起的皮肤和皮肤结构感染,2006年被FDA批准用来治疗由革兰氏阳性菌引起的菌血症和由耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的右侧心内膜炎[5]。因此，达托霉素已成为21世纪最具潜力和应用价值的抗生素之一，其医学价值、社会影响力与日俱增，市场前景广阔。但仍存在产量低、成本高的问题。因此，提高达托霉素的产量迫在眉睫。

发酵培养基的组成对于目的产物的形成有着显著的影响。对发酵培养基进行优化，可以显著提高目的产物产量[6，7]。近年来培养基优化方法已经由传统的耗时耗力的非统计优化方法逐渐发展为统计优化方法，其中最为常用的是Plackett-Burman 设计、最陡爬坡设计与响应面设计相结合的优化方法。Plackett-Burman 设计从多种因素中筛选出主要影响因子[8]，最陡爬坡设计使主要因子的水平接近响应面最大值，响应面设计最后确定因素的最优值[9]。该优化方法已广泛应用于工程设计、生物医药等领域，并取得了良好的效果[10]。

作者在此采用Plackett-Burman 设计、最陡爬坡设计与响应面设计相结合的优化方法对达托霉素的发酵培养基进行优化，以提高达托霉素的产量。

1 实验

1.1 试剂与仪器

达托霉素标准品，大连美伦生物技术有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；其它试剂均为分析纯。

1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司。

1.2 菌种与培养基

玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)GC-68是StreptomycesroseosporusNRRL11379的自然筛选突变株，自行保藏。

高氏一号培养基(斜面固体培养基，g·L-1)：可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，FeSO40.01，琼脂粉 20，加蒸馏水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

种子培养基(g·L-1):可溶性淀粉 20，KNO31，MgSO40.5，K2HPO40.5，NaCl 0.5，FeSO40.01，加蒸馏水定容至100 mL，pH值7.2～7.4。

基础发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖 7.5，糊精 10，可溶性淀粉 10，蛋白胨 8.5，酵母浸粉 6，干酪素 8.5，L-天冬氨酸 1，谷氨酸 0.5，MgSO40.5，K2SO40.5，K2HPO40.5，pH值7.2～7.4。

1.3 方法

将分离后的菌株接种于高氏一号培养基中，于30 ℃、湿度40%的条件下培养7 d；将斜面种子接种于已灭菌的种子培养基中，于30 ℃、220 r·min-1培养48 h左右；取1 mL种子培养液接种于设计的发酵培养基中，于30 ℃、220 r·min-1摇床发酵7 d(48 h时加入0.2 g·L-1正癸酸)，测定菌体生长量和达托霉素产量，以确定最优的培养基组成。

1.4 分析与检测

菌体生长量的测定采用干重法[11]。

达托霉素产量的测定采用HPLC法[11]：分析柱为反相ODS柱，流动相为含0.1%三氟乙酸的乙腈-水(45.5∶54.5，体积比)，流速1 mL·min-1，柱温30 ℃，柱压8～9 MPa，检测波长220 nm。

实验数据分析采用Design expert 7.0软件。

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman设计

根据单因子实验结果(数据未显示)，并结合玫瑰孢链霉菌菌体生长和发酵的特点，选取11个因素(包括不同的碳源、氮源和微量元素)，根据基础发酵培养基成分分别选择一个高水平、一个低水平，进行Plackett-Burman设计实验，考察培养基中的11个因素对达托霉素产量的影响，结果见表1。

表1 Plackett-Burman设计实验结果/g·L-1

对表1数据进行方差分析，结果见表2。

由表2可知，除变量C、D、G的Prob>F值小于0.05外，其它变量的Prob>F值均大于0.05。说明在Plackett-Burman设计中，变量C、D、G显著，而其它变量不显著[12]。表明变量C、D、G的模型贡献率较大，是构建模型的主要影响因素。运用Design expert 7.0软件对Plackett-Burman设计结果进行回归分析，得到关于响应面的多元一次方程：DAP=233.17778+0.53333A-1.39167B-9.56000C-5.35333D-2.30000E+7.35556F-28.00000G，作为主要影响因素的变量C、D、G在多元一次方程中的系数都为负值，表明它们在模型中的影响均为负效应，在后续的最陡爬坡设计中均需降低这些因素的实际浓度水平。

2.2 最陡爬坡设计

在Plackett-Burman设计得到的多元一次方程的基础上，根据其系数的正负及大小，设计主要因素C、D、G的最陡爬坡实验，选择合适的上升路径和步长，得出峰值，从而逼近其最大响应区域，为下一步的响应面设计做准备[12]。其它次要因素均依照其在方程中系数的正负分别取Plackett-Burman设计编码值的高水平或低水平。最陡爬坡设计实验结果见表3。

由表3可知，3#实验的达托霉素产量最高，达176.85 mg·L-1。故以3#实验培养基配方作为响应面设计中心点。

表2 Plackett-Burman设计实验方差分析

表3 最陡爬坡设计实验结果

2.3 响应面设计

以最陡爬坡设计得到的培养基配方为中心点，运用Design expert 7.0软件的Box-Behnken设计，针对主要因素C、D、G的浓度使用中值组合重新编码，以达托霉素的产量为响应值，设计3因素3水平的响应面设计实验[13]，其因素与水平见表4。

表4 Box-Behnken设计实验的因素与水平

糊精、可溶性淀粉和L-天冬氨酸的浓度水平如表4所示，其它次要因素均取最低水平，进行Box-Behnken设计实验，结果见表5。

表5 Box-Behnken设计实验结果

使用Design expert 7.0软件对表5数据进行方差分析，结果见表6。

表6 Box-Behnken设计实验的回归方程分析和方差分析

R2=0.9636，R2(adj)=0.9267

由表6可知，模型Prob>F值小于0.001,说明模型极为显著；变量A′、B′的Prob>F值小于0.001，极为显著；变量C′显著(Prob>F值小于0.05)；交互项A′C′极为显著(Prob>F值小于0.01)；虚拟变量不显著。说明此模型选择较为合理，分析结果较为可靠。回归方程的决定系数R2=0.9636,说明96.36%的实验数据可由回归方程解释，因此可用模型代替真实实验点进行数据分析。回归使用3-D Surface绘制响应面三维曲线，如图1所示。

图1 各因素交互作用响应面图

由图1可知，此响应面的最高点在设计的模型范围之内，说明此响应面的变量设计较好，可以进行后续分析以求得响应值最高点。

对实验结果进行二次回归，得到响应值拟合方程：DAP=180.20+0.037A′-1.63B′-1.76C′+5.03A′B′+1.05A′C′+2.98B′C′+2.20A′2-2.77B′2-0.45C′2，R2=0.9428。

利用软件的Numerical optimization 功能预测响应值最大值，模型各因素的组合为糊精7.0 g·L-1、可溶性淀粉6.66 g·L-1、L-天冬氨酸0.4 g·L-1,达托霉素最大产量预测值为186.0 mg·L-1。

2.4 验证实验

为了验证Design expert 7.0软件分析和预测结果的可信度，以预测响应值的最大值所对应的培养基组成为配方进行实验，同时以基础发酵培养基作对照，结果见图2。

图2 优化前后菌体生长及达托霉素产量

由图2可知，优化前后，培养基中各组分含量的变化对菌体生长的影响不太显著,但优化后稳定期菌体的干重明显升高。稳定期是达托霉素的主要合成时期，高的菌体浓度有利于达托霉素的合成，因此，由图中曲线可以看到，培养基优化后，达托霉素的产量显著上升，由优化前的106.7 mg·L-1最高可升到185.3 mg·L-1，提高了73.7%。这可能是由于，优化后的培养基使达托霉素合成和菌体生长有更好的平衡关系，使底物抑制作用降低，同时可以更好地为达托霉素的合成提供前体物质。

3 结论

采用Plackett-Burman 设计、最陡爬坡设计与响应面设计相结合的优化方法，使用Design expert 7.0软件对实验结果进行分析，得到了达托霉素的优化培养基中糊精、可溶性淀粉、L-天冬氨酸的浓度分别为7.0 g·L-1、6.66 g·L-1、0.4 g·L-1，在此条件下，达托霉素的产量达到185.3 mg·L-1，比优化前的106.7 mg·L-1提高了73.7%。

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