锌酞氰介导的光动力学疗法对小鼠Lewis肺癌细胞的影响研究*

李维娜 杨继庆* 刘渊声 文 峻 翟明明 屈学民

肺癌是最近50年以来全球范围内发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤，目前在很多世界发达国家和部分发展中国家已排到恶性肿瘤的第一位[1-2]，其治疗手段主要有手术疗法、化学疗法、放射疗法和新近出现的分子靶向疗法[3-4]等。尽管各种治疗手段均有很大进步，但5年生存率仍＜15%[5]。因此，如何更有效的治疗肺癌成为当今研究的热点。

光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种新的肿瘤治疗手段，具有快速起效、毒性较低和治疗创伤小等优点，在癌症治疗方面有着非常广泛的应用。本实验研究锌酞氰(Zinc Phthalocyanine,ZnPc)介导的光动力学疗法(ZnPc-PDT)对小鼠Lewis肺癌细胞的影响，探索了ZnPc-PDT杀伤Lewis肺癌细胞的最佳工作参数，为后期的动物体内实验提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验细胞

小鼠Lewis肺癌细胞株：由第四军医大学遗传与发育教研室惠赠，常规复苏，传代接种后，取其生长良好的第三代细胞完成本次实验。

1.2 主要试剂和仪器

ZnPc购自上海TCI公司，在暗室中称取ZnPc粉末11.5 mg，加入二甲基亚砜(DMSO)溶剂10 mL，待充分溶解后，避光分装后-20 ℃避光保存，添加DMSO配制成所需的不同浓度的溶液即可。四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sino-American Biotec公司，以磷酸盐缓冲液(PBS)配制MTT溶液5 mg/mL；过滤除菌，分装后避光-20 ℃保存。本实验还用到中国台湾BD Bioscience公司的凋亡试剂盒Annexin V/PI，培养基RMPI 1640等。

应用的主要仪器有670 nm DL-Y半导体激光治疗仪(第四军医大学数理教研室研制)，光功率计(LM-91C型)，紫外分光光度计(日本HITACHI公司),酶标仪(北京东胜创新公司)，流式细胞仪(美国BD Bioscience公司)等。

1.3 MTT检测法

接种小鼠Lewis肺癌细胞1×105个于96孔板内，加入光敏剂，4 h后进行光照；避光孵育12 h后每孔加入10 μl MTT溶液，恒温孵箱继续培养4 h；弃去培养基，加入100 μl DMSO，避光摇动混匀15 min；酶标仪测量492 nm处吸光度值。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

接种小鼠Lewis肺癌细胞2×104个于24孔板内，加入光敏剂，4 h后进行光照；避光孵育12 h后收集所有贴壁和悬浮细胞，用流式细胞仪进行分析。

1.5 数据分析

采用GraphPad Prism 5软件对数据进行处理和分析。

2 实验结果

2.1 ZnPc的光谱特性分析

利用分光光度计分别检测了ZnPc的吸收峰。如图1所示，ZnPc的吸收峰出现在670 nm处，因此本实验选择输出波长为670 nm的激光器激发ZnPc。

2.2 光敏剂浓度对Lewis细胞杀伤作用的影响对比研究

接种小鼠Lewis肺癌细胞于96孔板，加入ZnPc和溶液，浓度调节到0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，避光培养4 h，然后在暗室中用670 nm的激光光照5 min，激光能量密度均为120 mW/cm2。

图1 ZnPc的吸收峰

2.2.1 用MTT检测法检测PDT对细胞增殖的变化

用MTT法检测ZnPc-PDT对小鼠Lewis细胞的抑制率，用吸光度A492nm表示细胞的存活率(见表1)。

由表1数据可知，随着ZnPc浓度水平的增加，Lewis细胞在492 nm处的吸光值逐渐减小。利用t检验对相邻浓度的两组光敏剂分别进行比较可知，15 μmol/L和10 μmol/L时作用效果无显著性差异(t=1.739，P＞0.05)，其他相邻浓度水平间均存在显著性差异。

2.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

加入ZnPc使浓度分别达到10 μmol/L和20 μmol/L进行PDT处理，将经过ZnPc介导的PDT处理后的小鼠Lewis肺癌细胞，用流式细胞仪检测，左上角表示坏死细胞所占比例，右上角表示晚期凋亡细胞所占比例，左下角表示活细胞所占比例，右下角表示早期凋亡细胞所占比例(如图2所示)。

图2 不同浓度时流式细胞术分析结果

由图2显示，随着光敏剂浓度的增加，活细胞所占的比例逐渐减小。光敏剂浓度为0时，活细胞所占比例为87.78%；光敏剂浓度为10 μmol/L的ZnPc-PDT时活细胞所占比例为38.93%；光敏剂浓度为20 μmol/L的ZnPc-PDT时活细胞所占比例为26.24%，说明ZnPc介导的PDT的作用效果均比较明显，ZnPc-PDT在低浓度为10 μmol/L时即有较强的杀伤效果。

表1 浓度对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

表1 浓度对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

5 μmol/L和0 μmol/L比较，P=0.003； 10 μmol/L和5 μmol/L比较，P=0.001；15 μmol/L和10 μmol/L比较，P=0.133； 15 μmol/L和20 μmol/L比较，P=0.014

表2 光照时间对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

表2 光照时间对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

1 min与0 min比较，P=0.000； 2 min与1 min比较，P=0.001；3 min与2 min比较，P=0.039； 5 min与3 min比较，P=0.303

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表3 功率密度对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

表3 功率密度对ZnPc介导的PDT对细胞杀伤效果的影响(n=4，)

30 mW/cm2与0 mW/cm2比较，P=0.000； 60 mW/cm2与30 mW/cm2比较，P=0.001；90 mW/cm2与60 mW/cm2比较，P=0.082； 120 mW/cm2与90 mW/cm2比较，P=0.540

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2.3 光照时间对Lewis细胞杀伤作用的对比研究

接种小鼠Lewis肺癌细胞于96孔板，加入ZnPc溶液，浓度为20 μmol/L，避光培养4 h，然后在暗室中分别用635 nm和670 nm的激光光照0 min、1 min、2 min、3 min、5 min，激光能量密度均为120 mW/cm2。

2.3.1 用MTT检测法检测PDT对细胞增殖的变化

用吸光度A492nm表示细胞的存活率，比较0 min、1 min、2 min、3 min、5 min两种光敏剂对细胞的杀伤效果见表2。

由表2数据可知，随着光照时间的增强，ZnPc介导的PDT对小鼠Lewis肺癌细胞的杀伤作用逐渐增强，表现为492 nm处的吸光度值在逐渐减小。当光照时间为0 min、1 min、2 min、3 min时相邻两组间t值分别为12.68，6.257，2.631，P值均＜0.05，不同时间段的作用效果存在显著性差异；5 min和3 min时t=1.126，P＞0.05，无统计学意义，作用效果无显著性差异。随着照射时间的增长，PDT对细胞的杀伤作用逐渐增强，但当时间达到一定值后则失去统计学意义。

2.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡

图3 不同光照时间时流式细胞术分析结果

将经过ZnPc-PDT处理后的小鼠Lewis肺癌细胞，用流式细胞仪检测结果如图3所示。在进行ZnPc-PDT时，光照时间为0时，活细胞所占比例为88.62%；光照时间为2 min的ZnPc-PDT时活细胞所占比例为46.23%，5 min时活细胞所占比例为26.24%。说明ZnPc-PDT对Lewis肺癌细胞的杀伤效果明显，ZnPc-PDT在光照2 min时即有较强的杀伤效果。

2.4 光源功率密度对小鼠Lewis肺癌细胞杀伤作用的对比研究

接种小鼠Lewis肺癌细胞于96孔板，加入ZnPc溶液，浓度20 μmol/L，避光培养4 h，然后在暗室中分别用635 nm和670 nm的激光光照5 min，激光能量密度分别为0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2。

2.4.1 用MTT检测法检测ZnPc-PDT对细胞增殖的变化

用吸光度A492nm表示细胞的存活率，比较激光能量密度分别为0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2时，两种光敏剂对细胞的杀伤效果见表3。

由表3数据可知，随着功率密度的增强，ZnPc-PDT对Lewis细胞的杀伤作用均逐渐增强。当激光功率密度为0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2时，相邻组间t=9.059,5.812，P＜0.05，不同功率密度的作用效果存在显著性差异；当激光功率密度为60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2时，相邻组间t=2.085,0.6505，P＞0.05，无统计学意义，作用效果无显著性差异。随着功率密度的增强，PDT对细胞的杀伤作用逐渐增强，但当功率密度大到60 mW/cm2后则失去统计学意义，可能因杀伤能力已趋于饱和。

2.4.2 用流式细胞仪检测细胞凋亡

将经过ZnPc-PDT处理后的小鼠Lewis肺癌细胞，用流式细胞仪检测结果如图4所示。光功率密度为0时，活细胞所占比例为91.09%，光功率密度为60 mW/cm2时ZnPc-PDT活细胞所占比例为40.31%，120 mW/cm2时活细胞所占比例为26.24%。说明ZnPc-PDT的作用效果比较明显，在功率密度为60 mW/cm2时即有较强的杀伤效果。

图4 不同功率密度时流式细胞术分析结果

3 讨论

目前，利用PDT治疗肺癌方面的研究多以血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative，HPD)为光敏剂[6-8]，而HPD作为一代光敏剂的代表，虽然有着广泛的应用，但其组织选择性较差，光毒性较强，避光时间较长等缺点成为制约其发展的主要原因[9-10]。ZnPc属于二代光敏剂，具有避光时间短，代谢速度快，组分单一等特点，目前已在临床上广泛应用，而关于其在肺癌方面的研究还未见报道[11-12]。

本实验通过光谱分析可知光敏剂ZnPc的峰值单一，吸收峰波长为670 nm，说明其组分单一，不良成分较少；波长较长，对组织的穿透能力较强。在研究ZnPc-PDT中其浓度对小鼠Lewis肺癌细胞的杀伤作用时利用MTT法和流式细胞技术均显示，PDT的疗效在一定范围内随光敏剂浓度的增加而增强，但增强到一定值(10 μmol/L)以后相邻浓度不具有显著性差异，可能是由于杀伤能力已达到饱和。流式细胞技术显示，ZnPc-PDT在低浓度(10 μmol/L)时即有较强的杀伤效果。

在研究光照时间对Lewis肺癌细胞的杀伤作用时，同样MTT法和流式细胞技术检测发现，PDT的疗效在一定范围内随光照时间的增加而增强，MTT法显示当两者光照时间为3 min和5 min时，t=1.126，P＞0.05，不具备统计学意义，说明作用效果无显著性差异，可能是杀伤能力已达到了饱和。流式细胞技术显示两种光敏剂介导的PDT的作用效果均比较明显，ZnPc-PDT在光照2 min时即有较强的杀伤效果。在研究激光功率密度对ZnPc介导的PDT对Lewis肺癌细胞的杀伤作用时，MTT法和流式细胞技术结果显示对于同一种光敏剂，PDT的疗效在一定范围内随光源功率密度的增加而增强，MTT法显示两种光敏剂在能力密度达到60 mW/cm2以后，相邻光强下的细胞杀伤能力不具备统计学意义，可能是光敏化能力已趋于饱和。ZnPc-PDT在低功率密度下(60 mW/cm2)即有较强的杀伤效果。

以上结果表明，ZnPc-PDT对Lewis肺癌细胞的杀伤作用随光敏剂浓度、光照时间、光源功率密度的增加而增强，但增强到一定值后会趋于饱和；并且由ZnPc的谱线图可知，ZnPc的波峰相对单一即说明其成分单一，对细胞的毒副作用相对较小；ZnPc的波长较长，因此其对组织的穿透能力更强。研究初步表明，在肺癌方面ZnPc-PDT是一种高效，低不良反应的治疗方法，但需要在下一步的动物体内实验进行验证。

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