气相色谱法测定盐酸法舒地尔中有机溶剂残留量

2012-07-28方海燕方学勤刘元胜

中国医药导报 2012年5期

方海燕方学勤刘元胜

1.湖北省黄石市食品药品监督检验所生测室，湖北黄石 435000；2.湖北省黄石市世星药业有限责任公司，湖北黄石 435003

盐酸法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药物，它的分子结构为5-异喹啉磺酰胺衍生物，为RHO激酶抑制物，它抑制了RHO激酶参与的细胞黏附、细胞迁移、平滑肌细胞收缩、胞质分裂的调节，从而抑制了动脉粥样硬化的发生与发展。在日本1995年正式批准进入临床，用来防治慢性缺血性脑血管痉挛[1]。由于该药在合成过程中需使用甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺等有机溶剂，产品中的有机残留量对人体是有害，故应对原料药中有机溶剂残留量进行控制。由于现有文献中尚未发现这方面的研究，本试验根据ICH和《中国药典》2010年版二部对有机溶剂残留量测定的指导原则[2]，并参考有关文献[3-6]，采用气相色谱法测定了盐酸法舒地尔原料中的甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的含量，方法简便灵敏，结果准确可靠。

1 仪器与试药

岛津GC-14C气相色谱仪，氢火焰离子检测器（FID），CS-Light色谱工作站，梅特勒AL204分析天平；毛细管色谱柱 SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）。

盐酸法舒地尔（批号：20080601、20080602、20080603，自制），甲醇、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜均为色谱纯，二氯甲烷为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

由于N，N-二甲基甲酰胺是高沸点有机溶剂，采用其色谱条件不能有效将甲醇、二氯甲烷进行分离。因此，分别采用两种程序升温条件，测定甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺。FID检测器，检测器温度250℃，进样口温度200℃，载气为氮气，采用恒流模式，流速为12 mL/min，氢气流速50 mL/min，空气流速 500 mL/min，SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）毛细管柱，分流时间0.1 s，分流流速3 mL/s，进样量1 μL。采用岛津CS-light气相色谱工作站，色谱峰理论塔板数不低于5000，分离度大于1.5。

分析甲醇、二氯甲烷的程序升温：初始柱温55℃，平衡0.5 min，以40℃/min的速度升温至70℃，平衡1 min，以 40℃/min的速度升温至180℃，平衡3 min。

分析N，N-二甲基甲酰胺的程序升温：初始柱温50℃，平衡3 min，以20℃/min的速度升温至180℃，平衡3 min。

图1 甲醇、二氯甲烷对照品溶液图谱

2.2 溶液的制备

2.2.1 甲醇、二氯甲烷溶液的制备

2.2.1.1 对照品溶液的制备分别取甲醇、二氯甲烷适量，精密称定，用二甲基甲酰胺（DMF）稀释成1 mL约含甲醇300 μg、二氯甲烷60 μg的溶液，另加0.5 mL内标溶液。内标物质具体制备为：取分析纯苯约60 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加DMF并稀释至刻度，振匀。

2.2.1.2 供试品溶液的制备取盐酸法舒地尔1.0 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入0.5 mL内标溶液，用DMF稀释至刻度，振摇使溶解，即得。

2.2.2 N，N-二甲基甲酰胺溶液的制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备取N，N-二甲基甲酰胺定量稀释制成每1 mL中分别约含88 μg的溶液，另精密量取内标溶液0.5 mL置于该量瓶中，用20%甲醇稀释至刻度，振匀。内标物质具体制备为：取分析纯N，N-二甲基乙酰胺约80 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加20%甲醇稀释至刻度，振匀。

2.2.2.2 供试品溶液的制备另取本品约0.1 g，精密称定，取0.5 mL内标溶液，置于10 mL量瓶中，20%甲醇稀释至刻度，充分振摇。

图2 甲醇、二氯甲烷供试品溶液图谱

2.3 测定方法

分别取对照溶液和供试品溶液，按上述色谱条件测定，甲醇、二氯甲烷结果，见图1、2；N，N-二甲基甲酰胺结果，见图 3、4。

2.4 线性关系考察

分别精密称取甲醇、二氯甲烷适量，用DMF稀释成含甲醇 0.0657、0.6570、6.5700、65.7000、657.0000 μg/mL，含二氯甲烷 1.76、17.60、176.00、246.40、316.80 μg/mL，取以上各浓度溶液10 mL，分别加入0.5 mL苯内标溶液，用20%甲醇稀释成含 N，N-二甲基甲酰胺 0.166、1.660、16.600、66.400、83.000、99.600 μg/mL的溶液备用，取此系列浓度溶液10 mL分别加入0.5 mL N，N-二甲基乙酰胺内标溶液，取1 μL样品直接进样以AR/AS为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），计算甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的回归方程分别为Y=1.0122X+0.0029（r=1.0000）、Y=0.4387X+0.0002（r=0.9991）、Y=10.857X+0.056（r=0.9998）。结果表明甲醇在 0.0657～657.0000 μg/mL，二氯甲烷在 0.76～316.80 μg/mL，N，N-二甲基甲酰胺在0.166～99.600 μg/mL的浓度范围内呈较好的线性关系。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，连续测定6次，结果甲醇溶液中苯/甲醇的峰面积的RSD为1.02%，二氯甲烷溶液中苯/二氯甲烷的峰面积的RSD为1.61%，N，N-二甲基甲酰胺溶液中苯/DMF的峰面积的RSD为3.13%，符合《中国药典》2010年版规定的有机溶剂残留内标法测定精密度的要求（RSD不大于5%）。见表1。

2.6 最低检测限的测定

图3 N，N-二甲基乙酰胺对照品溶液色谱图

图4 N，N-二甲基乙酰胺供试品溶液色谱图

取“2.4”项下的标准溶液，采用逐步稀释法，按上述色谱条件进样，测得甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺的检测限（S/N=3）分别为 0.0657、1.1000、0.0166 μg/mL。

表1 残留溶剂测定精密度试验

2.7 回收率试验

2.7.1 甲醇、二氯甲烷回收率试验测定

分别量取甲醇、二氯甲烷对照储备液0.5、4.0、5.0 mL，置10 mL量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，作为浓度为12%、100%、120%的混合加样溶液。分别精密称取已知残留量的供试品（批号：20080603）各0.1 g，分别加以上各浓度的混合溶液10 mL使其溶解，摇匀，分别依法测定，计算各有机溶剂的平均回收率。见表2。

表2 甲醇、二氯甲烷回收率测定结果

2.7.2 N，N-二甲基甲酰胺回收率试验测定

分别量取N，N-二甲基甲酰胺对照储备液 4、5、6 mL，置10 mL量瓶中，加0.5 mL内标溶液，用20%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为浓度为80%、100%、120%的混合加样溶液。分别精密称取已知残留量的供试品（批号：20080601）各0.1 g，分别加以上各浓度的混合溶液10 mL使其溶解，摇匀，分别依法测定，计算N，N-二甲基甲酰胺平均回收率，见表3。

表3 N，N-二甲基甲酰胺回收率测定结果

2.8 样品测定

取盐酸法舒地尔样品3批，各约1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加0.5 mL内标溶液和DMF溶解并定容，摇匀，平行制备3份。加0.5 mL内标溶液和20%甲醇溶解并定容，摇匀，平行制备3份。按上述色谱条件进样，以内标法计算，取平均值作为测定结果。见表4。由表4可知，3批样品的残留溶剂均符合规定（残留溶剂甲醇≤0.3%，二氯甲烷≤0.06%，DMF≤0.088%）。

表4 残留溶剂检测结果（%）

3 讨论

3.1 进样方式的选择

通常采用顶空进样和直接进样的方法，由于N，N-二甲基甲酰胺沸点为180℃，不能采用顶空进样法，改用直接进样，但是N，N-二甲基甲酰胺出峰较晚，不能选用高沸点溶剂作溶媒，但如果选用低熔点溶剂作溶媒又干扰了甲醇及二氯甲烷的出峰，所以检测3种残溶不能共用同一种溶媒。因此，选用两种溶媒，采用两种不同的程序升温，进行测定样品中甲醇、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺含量。

3.2 色谱柱的选择

本实验室曾选用不同极性及不同口径的毛细管色谱柱，如 SE-54（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）、FFAP （25 m×0.32 mm，0.50 μm）经多次试验采用SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm）柱，可使 DMF 达到较好的基线分离，基线平直，色谱峰峰型对称，分离度较好，同时也能满足甲醇及二氯甲烷的检测要求。因此本次检测采用的是毛细管色谱柱 SE-54（30 m×0.53 mm，5.0 μm），此色谱柱为大口径色谱柱。