鸟氨酸脱羧酶基因沉默对子宫内膜癌细胞Ishikawa的影响

楚广民 张建波▲ 陈小兵▲ 刘红亮

1.河南省肿瘤医院 郑州大学附属肿瘤医院病理科，河南 郑州 450008；2.河南中医学院第一附属医院老年科，河南 郑州 450003

在真核生物代谢过程中，鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）是控制多胺生成的限速酶，多胺则是调控细胞增殖的重要因子，在肿瘤发生发展中起重要作用。在乳腺癌、肝癌等多种肿瘤研究中发现ODC和多胺高表达，抑制ODC活性可使多胺生成减少，从而抑制肿瘤发生发展[1-2]。本实验通过RNA干扰技术抑制ODC在子宫内膜癌Ishikawa细胞株的表达，探讨ODC在子宫内膜癌细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人子宫内膜癌细胞Ishikawa购自南京凯基生物科技有限公司细胞库，置于含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基中、5%CO2、37℃及饱和湿度培养箱中培养，2～3 d传代 1次，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2 主要试剂

DMEM-F12购自杭州吉诺生物医药技术有限公司。小牛血清购自杭州四季青公司；ODC抗体、β-actin抗体均购于Santa Cruz Biotechnology公司。Lipofectamine TM2000脂质体购于美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自Promega公司。SYBR Green RT-PCR试剂盒购自北京天根生物技术有限公司。噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和Trizol等试剂购自Sigma公司。DNA Marker购自天根生化科技有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。siRNA真核表达载体pSUPER-EGFP空质粒由郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室构建惠赠。

1.3 细胞转染

按照标准在6孔板进行细胞转染。ODC siRNA的序列，F：CACCCGAAGTAGAGGAACATTCAAGAGATGTTCCTCTAC TTCGGGTG；R：GTGGGCTTCATCTCCTTGTAAGTTCTCTACAAGGAGATGAAGCCCAC。构建了携带ODC siRNA的序列的真核表达载体pSUPER-EGFP-ODC。在无菌EP管内加入质粒4.0 μg，加入无双抗无血清培养基至250 μL混匀，静置5 min；另 lipofectamine TM2000脂质体 10 μL，加入无双抗无血清培养基至250 μL混匀，轻轻混合上述两种溶液，室温放置20 min备用。细胞弃去原培养基，用2 mL无血清的培养基孵育细胞2 h，弃去培养液加入上述溶液，将培养板置于细胞培养箱内孵育5 h后去除转染混合液，更换为普通全培基。实验分三组：Ishikawa组，pSUPER-EGFP组，pSUPEREGFP-ODC组。Ishikawa为未转染细胞；pSUPER-EGFP为转染空质粒细胞；pSUPER-EGFP-ODC为转染siRNA质粒细胞。

1.4 Real-time PCR检测ODC mRNA表达

收集各组细胞，用Trizol提取总RNA，按照反转录试剂盒上的步骤反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。ODC上游引物为TGGCTTCCAGAGGCCGACGA，下游引物为GACACAGGCAGGGTGCTGGC，扩增片段长度为126 bp；内参为β-actin，上游引物为GCCCTGGCACCCAGCACAAT，下游引物为GGAGGGGCCGGACTCGTCAT，扩增片段长度为150 bp。PCR 扩增条件为：95℃预变性 10 min，94℃变性 30 s，褪火 30 s，71℃延伸 30 s，40 个循环；融解曲线阶段：95℃ 15 s，56℃ 30 s，95℃ 15 s。 ODC mRNA 表达水平采用 2-△△Ct法评估。

1.5 Western blot检测ODC蛋白表达

选取各组处于对数生长期的细胞提取细胞总蛋白。取20 μL蛋白和 8 μL Loading在 6%浓缩胶和 12%分离胶SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移到PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭2 h，然后加入1∶500稀释的羊抗人ODC多抗和1∶400稀释的抗β-actin抗体室温震荡培育4 h，TBST液充分洗涤 5次，每次10 min。 加入1∶1000稀释的羊抗鼠IgG二抗，室温震荡培育4 h，TBST液充分洗涤3次，每次10 min。暗室中显色、曝光、显影和成像。

1.6 MTT测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的各组Ishikawa细胞经胰酶消化，以（1～2）×105个/mL的细胞密度接种于96孔板中，每组设5复孔。细胞在37℃、5%CO2条件下孵育，使之贴壁，依次分别培养 1、2、3、4、5、6 d。 结束培养前每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液 20 μL，继续在前述条件下培养 4 h，加入 DMSO 150 μL。 震荡10 min使紫蓝色结晶物充分融解。用酶标仪（Bio2rad 680）于570 nm波长测定每孔的吸光度（absorbance）。以各实验孔吸光度值减去空白对照孔吸光度值得出其A值来反映存活细胞数量，绘制细胞生长曲线。

1.7 流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况

用0.25%胰蛋白酶适度消化收集处于对数生长期的各组细胞，每组至少收集细胞数1×106个细胞，轻轻吹打制备单细胞悬液细胞后移入新的1.5 mL离心管中，4℃，500 g，离心5 min。小心移去上清液并用冰预冷PBS洗细胞2次。上流式细胞仪检测各组细胞周期和凋亡数据并进行资料分析。

1.8 统计学方法

采用SAS 6.12和SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，比较采用t检验，MTT结果采用两因素方差分析，其余结果采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ODC mRNA和蛋白的检测

PCR和Western Blotting结果示pSUPER-EGFP-ODC组ODC mRNA和蛋白的表达水平与Ishikawa和pSUPEREGFP比较，明显降低，差异有高度统计学意义（P<0.01），Ishikawa和pSUPER-EGFP比较差异无统计学意义 （P>0.05）（图 1、2）。

图1 ODC mRNA在三组Ishikawa细胞中的表达情况

图2 ODC蛋白在三组Ishikawa细胞中的表达情况

2.2 pSUPER-EGFP-ODC对Ishikawa细胞增殖的影响

MTT结果显示pSUPER-EGFP-ODC组Ishikawa细胞生长能力与Ishikawa和pSUPER-EGFP比较，明显降低，差异有高度统计学意义（P<0.01），Ishikawa和pSUPER-EGFP比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 pSUPER-EGFP-ODC对Ishikawa细胞增殖的影响

2.3 pSUPER-EGFP-ODC对Ishikawa细胞周期和凋亡的影响

流式细胞术结果显示ODC沉默后能阻滞Ishikawa细胞于期 G0/G1期pSUPER-EGFP-ODC组细胞百分比 （66.22±3.33）%与 pSUPER-EGFP 组的 （53.83±4.51）%和 Ishikawa组的（50.25±3.48）%比较，明显增高，差异有高度统计学意义（F=14.523，P<0.01）；S 期细胞百分比pSUPER-EGFP-ODC组的（19.98±3.54）% 与 pSUPER-EGFP 组 的 （34.51±2.37）% 和Ishikawa组的（37.1±2.91）%比较，明显降低，差异有高度统计学意义（F=28.778，P<0.01）。ODC 沉默后能诱导 Ishikawa组细胞 凋 亡 ，pSUPER-EGFP-ODC组 细 胞 凋 亡 率 [（13.86±3.07）%]与 pSUPER-EGFP 组的（2.31±1.09）%和Ishikawa组的（2.17±0.99）%比较，明显增高，差异有高度统计学意义（F=34.866，P<0.01）（图 4、5）。

图4 pSUPER-EGFP-ODC对Ishikawa细胞周期的影响

图5 pSUPER-EGFP-ODC对Ishikawa细胞凋亡的影响

3 讨论

子宫内膜癌是一种原发于子宫内膜的恶性肿瘤，是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，据统计近几年来发病率在世界范围内呈增高趋势[3]。目前子宫内膜癌的主要治疗手段是早期以手术治疗为主辅以放疗、化疗等手段，晚期患者则主要以手术缩瘤、术后辅助放疗、化疗及激素治疗，但疗效差，生存期短。基因治疗成为近年来子宫内膜癌研究热点之一。ODC作为多胺合成的限速酶，能催化鸟氨酸生成腐胺，后者再生成精脒和精胺[4]。研究发现ODC基因及其酶活性在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中均呈显著增高状态，且ODC的高表达是疾病不良预后的指标[5-7]。有研究报道[8-9]，ODC的抑制剂二氟甲基鸟氨酸（DFMO）能有效抑制结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞的生长，但由于该药毒副作用大，限制了其在临床中的应用。因此有必要探讨以ODC为靶点新的抗肿瘤治疗策略，其中RNA干扰技术是研究方向之一。

本研究以子宫内膜癌细胞株Ishikawa为研究对象，以ODC为肿瘤治疗靶点，用RNA干扰技术特异性地下调ODC基因的表达，探讨ODC表达下降对子宫内膜癌细胞株Ishikawa的影响。本研究首先成功沉默了子宫内膜癌Ishikawa细胞ODC的表达，同时设pSUPER-EGFP转染组和亲本Ishikawa细胞作为对照。为证明ODC的沉默效果，笔者分别用realtime PCR和Western blot方法检测ODC mRNA和蛋白的表达情况，结果显示pSUPER-EGFP-ODC的mRNA和蛋白质表达水平均明显下降。说明本实验的脂质体介导的RNA沉默序列可以有效地下调ODC基因表达。这与其他学者以往报道的结果相符合，如Moussavi等[10]证实用病毒载体介导的RNA干扰可以在前列腺癌细胞LNCaP，C4-2，DU145 and PC-3下调ODC基因的表达。为进一步证实ODC基因表达下调后对子宫内膜癌细胞株Ishikawa的影响，笔者分别用MTT和流式细胞术来测定细胞的增殖能力和细胞周期和凋亡情况。本研究结果显示，pSUPER-EGFP-ODC细胞与pSUPER-EGFP转染组和亲本Ishikawa细胞相比ODC基因沉默的细胞的增殖活性明显受到抑制，细胞阻滞于G0/G1期，S期细胞数相应减少，并诱导细胞凋亡。

总之，本实验用RNA干扰技术引起ODC基因沉默并抑制了子宫内膜癌细胞株Ishikawa的生长，这是ODC基因沉默抑制子宫内膜癌细胞生长的有力证据，为ODC基因应用于子宫内膜癌的基因治疗提供了实验依据。

[1]Deng W，Jiang X，Mei Y，et al.Role of ornithine decarboxylase in breast cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin，2008， 40（3）：235-243.

[2]Kubo S，Tamori A，Omura T，et al.Ornithine decarboxylase activity in the non-cancerous hepatic tissue of patients with hepatocellular carcinoma[J].Hepatogastroenterology，2000，47（33）：820-823.

[3]Ulrich LS.Endometrial cancer， types， prognosis， female hormones and antihormones[J].Climacteric，2011，14（4）：418-425.

[4]Ma Q，Wang Y，Gao X，et al.L-arginine reduces cell proliferation and ornithine decarboxylase activity in patients with colorectal adenoma and adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res，2007，13（24）：7407-7412.

[5]Nakazawa K，Nemoto T，Hata T，et al.Single-injection ornithine decarboxylase-directed antisense therapy using atelocollagen to suppress human cancer growth[J].Cancer，2007，109（5）：993-1002.

[6]Hoshino Y，Terashima S，Teranishi Y，et al.Ornithine decarboxylase activity as a prognostic marker for colorectal cancer[J].Fukushima J Med Sci，2007，53（1）：1-9.

[7]Elmets CA，Athar M.Targeting ornithine decarboxylase for the prevention of nonmelanoma skin cancer in humans[J].Cancer Prev Res（Phila），2010，3（1）：8-11.

[8]Laukaitis CM，Gerner EW.DFMO：targeted risk reduction therapy for colorectal neoplasia[J].Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25（4-5）：495-506.

[9]Nie L，Feng W，Diaz R，et al.Functional consequences of polyamine synthesis inhibition by L-alpha-difluoromethylornithine （DFMO）：cellular mechanisms for DFMO-mediated ototoxicity [J].J Biol Chem，2005， 280（15）：15097-15102.

[10]Moussavi M，Moshgabadi N，Fazli L，et al.Fibroblast growth factor and ornithine decarboxylase 5'UTRs enable preferential expression in human prostate cancer cells and in prostate tumors of PTEN （-/-）transgenic mice[J].Cancer Gene Ther，2012，19（1）：19-29.