Bcl-2、CytC和caspase-3在实验性精索静脉曲张大鼠生精细胞中的表达及意义

成建军 张雁钢 李超鹏

1.山西医科大学，山西 太原 030001；2.山西医学科学院 山西大医院，山西 太原 030001

精索静脉曲张（varicocele，VC）即精索内蔓状静脉丛呈不同程度的扩张和迂曲，是青年男性泌尿科常见疾病，发病率约15%（8%～20%）。发病以左侧为主，占70%以上，是引起男性不育的重要原因之一。目前对于VC导致不育的研究主要集中在睾丸局部缺氧、代谢产物返流等方面[1]。但VC导致男性不育的确切机制仍然存在较大争议。本实验通过探讨Bcl-2、细胞色素C（CytC）和caspase-3在精索静脉曲张大鼠生精细胞中的表达及三者与睾丸组织凋亡的关系，期望得到VC导致男性不育的凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 模型的建立和分组

雄性Wistar大鼠72只，鼠龄为6周，体重115～135 g。72只雄性Wistar大鼠随机分为6组，分别为A1组、A2组、A3组、B1组、B2组、B3组；A1组、A2组和 A3组为实验组，B1组、B2组和B3组为对照组。选取36只大鼠建立ELV模型，36只行对照手术。模型建立方法：将左肾静脉与0.55 mm的自制金属杆一起结扎，造成左肾静脉狭窄，可使左肾静脉直径缩小约一半，建立青春期大鼠实验性左侧精索静脉曲张（experimental left varicocele，ELV）模型。对照组游离左肾静脉，但不结扎。术后2、4、8周，分别取造模成功的大鼠（实验组6只及对照组6只），并取左侧睾丸。以精索静脉直径大于1 mm、左肾无萎缩为模型建立的标准。其中8周（A3）实验组未达到实验所需的动物模型数，造模成功5例；由A1及A2组剩余模型饲养达8周时随机取1例补充。

1.2 标本采集

模型大鼠及对照组大鼠的左侧睾丸组织，用福尔马林液浸泡48 h，包埋蜡块。

1.3 标本处理

1.3.1 HE染色 5μm厚度切片，脱蜡，苏木素-伊红（HE）染色后封片。

1.3.2 免疫组化 切片厚度5μm，采用SP法检测，一抗、SP试剂盒和DAB显色剂购自博奥森生物公司，操作严格按照说明书进行操作。细胞成分呈棕黄色为阳性表达。阴性对照步骤同实验组，其中由PBS代替一抗。用显微镜观察并拍照免疫组化切片，用BI-2000医学图像分析系统分析Bcl-2、CytC和caspase-3在大鼠睾丸组织中的表达，并测量阳性细胞平均灰度值。平均灰度值越低，免疫反应阳性越强。

1.3.3 TUNEL 切取5μm厚睾丸组织石蜡切片，实验步骤严格按北京中山金桥公司提供的试剂盒说明书检测细胞凋亡，细胞核染成棕色者为TUNEL阳性细胞，光镜下（×400）每张切片选取10个视野，计数500个细胞，计算生精细胞中的凋亡细胞所占百分率，作为生精细胞的凋亡指数（AI）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 17.0软件包进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间的比较采用方差分析，两两间的比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色

对照组睾丸生精上皮完整，各级生精细胞及精子排列有序。ELV 2周组无明显变化。ELV 4周组睾丸生精细胞上皮变薄，不完整，曲细精管管腔增大，精子明显减少，各级生精细胞减少，并可见一些细胞的染色质边集化，呈环状。ELV 8周组生精上皮基膜破裂，一些曲细精管中出现“多核巨细胞”（multinucleated giant cells），即多个细胞核聚集形成一个大的细胞团块，其中一些细胞核染色质明显边集化，呈环状，间质细胞水肿增大。

2.2 免疫组化

Bcl-2、CytC和caspase-3蛋白在实验组和对照组的各级生精细胞细胞质和细胞核中均可见到表达，阳性结果均为棕黄色物质分布。两组的平均灰度值见表1。

表1 实验组、对照组免疫组化平均灰度值（）

表1 实验组、对照组免疫组化平均灰度值（）

注：与对照组相同时间段比较，◆P＜0.05；与本组2周时比较，▲P＜0.05；与本组4周时比较，★P＜0.05

组别 只数Bcl-2 CytC caspase-3实验组2周4周8周对照组2周4周8周6 6 6 6 6 6 113.14±10.15 141.56±6.16◆▲152.28±4.97◆▲★161.02±8.74 149.86±3.97◆▲138.69±8.08◆▲★162.38±7.85 140.44±6.81◆▲129.04±6.66◆▲★113.06±5.12 114.96±12.20 110.81±4.79 163.56±6.34 161.30±3.41 159.38±2.57 168.75±8.00 170.68±6.87 171.47±7.17

2.3 TUNEL法检测凋亡

对照组中可见少量细胞凋亡细胞，主要集中在次级精母细胞及分裂期的精子细胞。2周实验组可见极少量生精细胞细胞凋亡；4周实验组可见曲细精小管中各级生精细胞较对照组及2周实验组凋亡增加；8周实验组可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡，管腔变薄，管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。见表2。

表2 实验组和对照组凋亡指数（%）

3 讨论

细胞凋亡又叫程序性细胞死亡，是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的，其具体的过程机制尚不明确，Bcl-2是一种细胞膜蛋白，主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上[2]，高水平的Bcl-2蛋白有抑制细胞死亡等作用，是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白[3]。Tanaka等[4]证实Bcl-2能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC是一个线粒体起源的细胞凋亡信号，Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质，而Bax、Bak可与Bcl-2结合，阻止其对CytC释放孔道的抑制作用，从而促进CytC从线粒体释放，引起凋亡[5]。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化，进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下，caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中，无活性，当细胞接受凋亡刺激时，其被激活，而诱导凋亡[6]。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[7]。

本实验发现，ELV 2周时，实验组及对照组生精细胞凋亡指数比较未见明显差异，实验组及对照组Bcl-2、CytC和caspase-3表达未见明显变化。有实验表明VC对睾丸的损害随时间进展而累积[8]，此时实验组与对照组凋亡指数无明显差异可能是因为VC对睾丸损害的累积效应尚不足以诱导生精细胞凋亡增加，或者睾丸组织通过多种机制产生代偿作用降低了VC对睾丸损害的累积效应使其不足以诱导生精细胞凋亡增加。ELV 4周时，实验组生精细胞凋亡指数及CytC、caspase-3表达较对照组显著升高，实验组Bcl-2表达较对照组显著降低。可见随着睾丸损害的时间累积效应增加，睾丸组织失代偿导致睾丸生精细胞Bcl-2、CytC和caspase-3表达显著变化，最终导致生精细胞凋亡增加。ELV 8周时，实验组生精细胞凋亡指数及CytC、caspase-3表达较ELV 4周组进一步显著升高，实验组Bcl-2表达较ELV 4周组进一步显著下降。可见随着睾丸损害时间累积效应的增加，对睾丸生精细胞Bcl-2、CytC和caspase-3表达的影响进一步增加、生精细胞损害较前进一步加重。有研究发现Bcl-2通过干扰CytC的释放阻断caspase蛋白酶的激活，从而抑制凋亡[5],孙宝华等[9]发现Bcl-2不仅通过抑制CytC等进而抑制caspase-3的活化，还参与抑制caspase-3的合成。本实验中Bcl-2与CytC、caspase-3的表达随时间累积变化趋势相反，且变化存在同步性，与孙宝华等的研究发现一致。

本试验中，ELV大鼠生精细胞Bcl-2表达随时间显著下降，CytC、caspase-3表达随时间显著升高，ELV大鼠生精细胞凋亡指数随时间显著增大；Bcl-2与CytC、caspase-3的表达变化呈现同步性且趋势相反。可见，VC可通过多种机制影响Bcl-2表达，进而导致CytC、caspase-3的表达变化，使大鼠睾丸生精细胞凋亡增加进而影响大鼠的睾丸生精功能。

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