盐酸戊乙奎醚对失血性休克大鼠肠黏膜的保护作用

蒋志平 夏中元 张 蕾 孟庆涛 李文澜 吴 迪 贾一帆 侯家保

1.武汉大学人民医院麻醉科，湖北 武汉 430061；2.湖北省随州市妇幼保健院麻醉科，湖北 随州 441300

失血性休克是临床常见现象，其主要的病理生理是所有的组织器官得不到足够的血液和氧气来维持基本的代谢活动，随后的再灌注常使损伤进一步恶化[1]。近年研究发现，肠道是失血性休克中器官功能障碍的始动器官和重要靶器官之一，肠黏膜屏障功能是影响失血性休克临床转归的重要因素，因此保护肠黏膜屏障功能是改善失血性休克患者预后的关键措施[2]。

盐酸戊乙奎醚是一种高选择性抗胆碱能药物，具有潜在的调控应激反应、稳定细胞膜、改善微循环等作用[3-5]，临床已广泛应用于脓毒症、急性肺损伤的防治，但其对失血性休克导致的肠黏膜屏障功能损伤是否具有保护作用及其作用机制研究较少。本研究拟用大鼠失血性休克模型，观察不同剂量盐酸戊乙奎醚预处理对肠黏膜屏障功能损伤的防治作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型及分组

SD 大鼠，（320±20）g，2%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后置于仰卧位。按无菌术要求暴露右侧股动脉并置管（PE-24G）用来放血和测压；尾静脉置管用来给药、补液和输血。在手术操作结束后，大鼠被随机分配至4个组（n=8）：对照组、休克组、小剂量盐酸戊乙奎醚组（0.15 mg/kg）、大剂量盐酸戊乙奎醚组（0.30 mg/kg）。对照组和休克组通过尾静脉在10 s内快速输注0.5 mL生理盐水；小剂量盐和大剂量酸戊乙奎醚组给予0.5 mL包含相应剂量盐酸戊乙奎醚的稀释液。0.5 mL肝素盐水（10 U/mL）用来确保盐水或药物进入到大鼠体内。30 min之后，按27 mL/kg经动脉通道在10 min之内匀速抽取血液诱发失血性休克，并通过放血或输血使大鼠股动脉压维持在（40±5） mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。维持休克状态60 min后，抽取的血液和乳酸林格液 （32 mL/kg）在30 min之内通过尾静脉匀速输注到大鼠体内复苏。复苏4 h后处死大鼠取8 cm末端回肠进行检测。

1.2 观察指标

肠道中超氧化物歧化酶（SOD）和丙戊二醛（MDA）含量按试剂盒说明（建成生物制剂公司，南京，中国）使用酶标仪测定。线粒体蛋白含量用BCA法测定（贝斯特公司，上海，中国）。

采用硝酸盐还原酶法测定一氧化氮（NO）；通过原子吸收分光光度法测定Ca2＋含量。Tonometry张力计置入乙状结肠，依照Henderson-Hasselbach[6]方法观察并计算pHi。使用标准的HE程序对组织进行染色并按Chiu法[7]对切片评分。TUNEL（罗氏生物试剂公司，德国）染色被用来检测肠黏膜细胞凋亡。每张切片在荧光显微镜（尼康90i，尼康公司，日本）下随机选择5个视野（×400），计数阳性和阴性细胞核。以凋亡指数表示每张切片凋亡情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行处理。计量资料数据以均数±标准差（）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复苏4 h后大鼠肠黏膜中SOD和MDA含量

与对照组比较，休克组和大、小剂量盐酸戊乙奎醚组均能显著降低大鼠肠黏膜SOD活性并增加MDA浓度 （均P＜0.05）。与休克组比较，大剂量盐酸戊乙奎醚组能显著升高大鼠肠黏膜SOD活性并降低MDA浓度（P＜0.05），小剂量盐酸戊乙奎醚对肠黏膜SOD和MDA无明显影响 （P＞0.05）。见表 1。

表1 复苏4 h后大鼠肠黏膜中SOD和MDA含量（）

表1 复苏4 h后大鼠肠黏膜中SOD和MDA含量（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与休克组比较，#P＜0.05

组别 只数 SOD（nU/mL） MDA（nmol/mL）对照组休克组小剂量盐酸戊乙奎醚组大剂量盐酸戊乙奎醚组8888382.16±98.65268.88±90.24*288.54±89.76*325.77±72.13*#5.96±1.6810.71±1.72*9.96±1.74*7.73±1.56*#

2.2 复苏4 h后大鼠肠黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值

与对照组比较，休克组和大、小剂量盐酸戊乙奎醚组均能显著升高大鼠肠黏膜NO、Ca2＋含量并降低pHi值 （均P＜0.05）。与休克组比较，大剂量盐酸戊乙奎醚组能显著降低大鼠肠黏膜 NO、Ca2＋含量并升高 pHi值（P＜0.05），小剂量盐酸戊乙奎醚对肠黏膜NO、Ca2＋含量及pHi值无明显影响 （P＞0.05）。见表 2。

2.3 复苏4 h后大鼠肠黏膜细胞凋亡率和HE含量评分

大剂量盐酸戊乙奎醚预处理可抑制缺血再灌注所致的肠黏膜细胞凋亡（P＜0.05）。但小剂量盐酸戊乙奎醚对肠黏膜细胞凋亡无明显影响（P＞0.05）。大剂量盐酸戊乙奎醚预处理显著减轻缺血再灌注所致的肠黏膜病理学改变，降低切片HE评分（P＜0.05）。而小剂量盐酸戊乙奎醚对肠黏膜病理学改变无明显改变（P＞0.05）。见表3。

表2 复苏4 h后大鼠肠黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值（）

表2 复苏4 h后大鼠肠黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与休克组比较，#P＜0.05

组别 只数 NO（μmol/g） Ca2＋（μmol/g） pHi对照组休克组小剂量盐酸戊乙奎醚组大剂量盐酸戊乙奎醚组888857.4±3.973.6±5.1*70.8±4.2*64.5±5.4*#2.27±0.322.93±0.35*2.74±0.39*2.44±0.29*#7.324±0.1026.978±0.152*7.022±0.105*7.192±0.118*#

表3 复苏4 h后大鼠肠黏膜细胞凋亡率和HE评分（）

表3 复苏4 h后大鼠肠黏膜细胞凋亡率和HE评分（）

注：与休克组比较，#P＜0.05

组别 只数 凋亡率（%） HE评分（分）休克组小剂量盐酸戊乙奎醚组大剂量盐酸戊乙奎醚组88818.26±9.6515.38±8.977.75±7.26#3.64±0.763.34±0.731.91±0.66#

3 讨论

前期的研究已经证实盐酸戊乙奎醚通过抑制NO和MDA的生成，并增加SOD活性来维持组织、器官的氧化平衡，从而在脓毒症、急性肺损伤等应激事件中发挥器官保护作用[3-5，8]。在本实验中，笔者发现大剂量盐酸戊乙奎醚预处理显著降低肠黏膜NO、MDA及Ca2＋的含量；增强SOD活性和pHi值；并降低肠黏膜细胞凋亡率及组织病理学评分。这些证据表明大剂量盐酸戊乙奎醚预处理可减轻缺血再灌注所致的肠黏膜损伤。

在休克组，笔者发现肠黏膜MDA含量显著增高而SOD活性显著降低。MDA是脂质过氧化反应产物之一，因此MDA水平增高预示着肠黏膜结构的破坏；肠黏膜的通透性增加，最终导致肠黏膜功能障碍[9]。相反，SOD被认为是组织抗氧化损伤的关键酶之一，研究甚至发现抗氧化酶活性与生物体寿命存在密切相关[10]。先前的研究指出，盐酸戊乙奎醚在缺血再灌注损伤中发挥抗氧化特性而对组织起保护作用[8]。在本实验中，结果清晰显示大剂量盐酸戊乙奎醚预处理减少肠黏膜中脂质过氧化反应产物MDA含量而显著增加SOD活性。提示大剂量盐酸戊乙奎醚预处理有效保存肠黏膜的抗氧化功能，因此能有效抑制肠黏膜损伤。

NO是另一反映组织氧化平衡的重要指标，其过度表达可直接引起细胞毒作用或通过生成氧自由基从而抑制细胞线粒体的氧化呼吸作用，导致能量代谢障碍，细胞脂质过氧化损伤，最终引起肠黏膜损伤[11-12]。事实上，NO是否促进缺血再灌注肠黏膜损伤尚有争议。有学者发现，NO可以增加肠黏膜血流量，促进黏膜溃疡的修复，对胃肠道有保护作用[13]。尽管对于NO是否促进缺血再灌注肠黏膜损伤有争议，但越来越多的证据表明NO促进缺血再灌注肠黏膜损伤[11-12]。在本实验中，笔者也发现NO含量在肠黏膜损伤后呈现升高的趋势，提示NO可能参与了缺血再灌注后小肠黏膜损伤这一过程；并且笔者还发现大剂量盐酸戊乙奎醚预处理能有效抑制NO在肠黏膜中升高。

目前认为，细胞内钙超载是细胞不可逆损伤的共同通路。休克再灌注后有效循环血容量不足、细胞缺氧，导致氧化还原功能失衡，大量氧自由基对细胞质膜和ER/SR膜的破坏，肠黏膜屏障受损，使大量的Ca2+从肌浆网释放至胞浆内或胞外，黏膜细胞内外Ca2+含量均明显增加[14]。细胞钙含量的持续超载又促进细胞损伤，加重肠黏膜绒毛结构和黏膜屏障破坏[14]。本结果显示，伴随氧化还原功能失衡，休克组肠黏膜Ca2+浓度明显升高，提示肠黏膜细胞功能受损或抑制。这与先前的研究结果是一致的。而盐酸戊乙奎醚在先前的研究中可有效抑制缺血再灌注所致组织Ca2+浓度升高[15]；在此笔者同样发现大剂量盐酸戊乙奎醚预处理显著抑制肠黏膜组织Ca2+浓度升高。

维持正常的氧化还原功能平衡和适当的Ca2+浓度是细胞生存的必要条件之一，而氧化还原功能障碍和Ca2+超载是导致细胞死亡常见原因。在休克组，笔者发现伴随着肠黏膜中氧化还原功能失衡和Ca2+浓度增高的是细胞死亡的增加。与此相反的是，大剂量盐酸戊乙奎醚预处理抑制了缺血再灌注所致的氧化还原功能失衡和Ca2+浓度增高，同时笔者也发现肠黏膜细胞凋亡被抑制，这可能是盐酸戊乙奎醚发挥保护作用的机制之一。

缺血再灌注导致器官功能障碍的重要机制之一就是诱导大量的功能细胞死亡[1，16]。当缺血再灌注导致的细胞死亡被抑制，器官功能能得到有效改善[17]。盐酸戊乙奎醚在先前的报道中有效抑制细胞死亡从而改善了缺血再灌注器官的功能[8]。在本实验中，笔者发现与大剂量盐酸戊乙奎醚抑制肠黏膜细胞凋亡一致，pHi和组织病理学得到显著改善，提示肠黏膜功能得到保存。

在本实验中，大剂量盐酸戊乙奎醚预处理对休克大鼠肠黏膜提供有效的保护作用；抑制肠黏膜细胞死亡和保存抗氧化功能可能是盐酸戊乙奎醚实现其保护作用机制之一。本实验可能为改善失血性休克预后提供一种新的思路。

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