金橙G共振光散射法测定脱氧核糖核酸

2012-07-27高雪敏李生泉樊玮鑫郝桂青

化学与生物工程 2012年7期

高雪敏，李生泉，樊玮鑫，郝桂青

(山西农业大学分析测试中心，山西太谷 030801)

脱氧核糖核酸(DNA)是重要的生物大分子，也是遗传信息的载体和基因表达的物质基础。核酸的定量测定可为生物体体液中其它组分的测定及遗传疾病的诊断提供重要信息，因而成为人们关注和研究的重要课题。

目前，测定核酸的常用方法有化学发光法[1～3]、光度分析法[4～6]、荧光分析法[7,8]、共振光散射(RLS)法[9,10]及电化学法[11,12]等。共振光散射法是一种新的光谱分析技术，因其灵敏度高、操作简单，越来越受到分析工作者的重视。金橙G(OG)是一种偶氮类生物染色剂，利用其共振光散射信号测定DNA的方法尚未见报道。基于DNA可以增强OG的共振光散射信号，且在一定范围内其增强值与DNA的浓度呈线性关系，作者建立了一种定量测定DNA的共振光散射法，并用于测定合成样品中DNA的含量。

1 实验

1.1 试剂与仪器

OG储备溶液 (1×10-3mol·L-1)；鲱鱼精DNA(hsDNA，100 μg·mL-1)，4 ℃冰箱保存，使用时稀释。所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

RF-5301型荧光分光光度计，日本岛津；pHS-3C型pH计，上海世义精密仪器有限公司。

1.2 方法

在10 mL 容量瓶中依次加入OG 0.4 mL、一定量的hsDNA标准溶液，用二次蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置 5 min。选择激发狭缝宽度为5 nm、发射狭缝宽度为5 nm，于λem=λex=358 nm处，分别测定样品溶液共振光散射强度I和参照溶液共振光散射强度I0，并根据△I=I-I0计算DNA对OG共振光散射强度的增强值△I。

2 结果与讨论

2.1 共振光散射(RLS)光谱特征

考察了不同激发波长下OG的散射光谱，见图1。

cOG=4×10-5 mol·L-1 1～3.λex=300 nm,350 nm,400 nm

从图1可以看出，OG有较强的共振瑞利散射和微弱的拉曼散射。进一步考察了不同DNA浓度的OG-DNA体系在λem=λex下同步扫描的共振光散射光谱，见图2。

cOG=4.0×10-5 mol·L-1 1～6,cDNA(μg·mL-1):0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5

从图2可以看出，OG本身的RLS信号较弱，在加入DNA后，其RLS信号明显增强，且随着DNA浓度的不断增大，△I也在增大，在241 nm、297 nm、358 nm附近出现了增强的共振光散射特征峰，其中358 nm处△I值最大。因此，实验选择358 nm为工作波长。

2.2 OG浓度的选择

考察了1.0×10-6～1.0×10-3mol·L-1范围内不同浓度OG的共振光散射强度。结果发现，当浓度为4.0×10-5mol·L-1时，OG的共振光散射强度达到最大。因此，实验选择OG的工作浓度为4.0×10-5mol·L-1。

2.3 介质酸度的选择

考察了pH值在3.0～12.0 范围内不同pH值对△I的影响。结果发现，pH值在5.8～9.0范围内，△I值比较稳定，其中pH值为7.0时△I值最大，因此，实验选择 pH值为7.0，不需要加入任何缓冲溶液。

2.4 反应时间的选择

考察了反应时间对样品溶液△I的影响。结果发现，样品溶液的△I在反应5～60 min保持稳定，因此，实验选择反应时间为5 min。

2.5 反应温度的选择

在10～40 ℃范围内考察了反应温度对△I的影响。结果发现，在20～26 ℃范围内，△I值基本没有变化且达到了最大值，27 ℃时有所下降。30 ℃之后则迅速下降，因此，实验选择在室温下进行。

2.6 线性范围和检出限

用100 μg·mL-1的hsDNA储备液配制一系列hsDNA标准溶液，在上述最佳的反应条件下，按实验方法测定样品的△I值，当DNA的质量浓度为0.053～1.20 μg·mL-1时(线性范围下限采用10σ法)，体系的△I值与DNA质量浓度呈良好的线性关系。其线性回归方程为：△I=968.9c，相关系数R2=0.9909。方法的检测限为0.0159 μg·mL-1(3σ法)。

2.7 共存物质的影响

最佳实验条件下，考察了共存物质对0.8 μg·mL-1的DNA测定的影响，在相对误差±5%范围内，可允许存在的各种物质的浓度倍数分别为： Ca2+(50)、Cr3+(100)、Mg2+(1000)、Na+(1500)、K+(1500)、Cu2+(40)、Fe3+(2)、Al3+(3)、Zn2+(150)、F-(1500)、I-(600)、三乙醇胺(1000)、葡萄糖(600)。Fe3+和Al3+对测定干扰较大，这是因为Fe3+和Al3+能和DNA发生络合反应。实际测定中，可用F-掩蔽Fe3+，用三乙醇胺掩蔽 Al3+。