HPLC-ICP-MS法研究5种含雄黄中成药的可溶性砷及其形态

2012-07-26李丽敏王欣美王枚博

中成药 2012年11期

李丽敏，夏晶，王欣美，王枚博，王柯，季申

(上海市食品药品检验所，上海201203)

矿物药雄黄主要成分是四硫化四砷 (As4S4)和硫化砷 (AsS)，此外雄黄中还含有少量的As2O3或As2O［1］5。砷为剧毒元素，国际上对其有严格的限量标准［2-3］，故雄黄安全性受到质疑。然而许多含雄黄传统中药对一些疑难杂症有特殊疗效，近年国内医学研究发现含雄黄的复方制剂或单方对于治疗血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病甚至实体瘤有着显著效果［4-6］，雄黄中砷虽然有毒性但也可能是治疗的有效成分。许多研究者对含雄黄中药用量与毒性展开讨论［7-8］，其焦点是该类制剂中雄黄所含砷引发的毒性问题;研究结果表明，含雄黄中药制剂经口服后，其所含的砷并非全部被人体吸收［9］，说明雄黄中所含有的大量不被机体所吸收的砷是无效或无毒成分。

砷元素作用于人体，其活性和毒性与其存在形态密切相关。雄黄中主成分砷进入机体后会发生生物转化，经酶催化通过氧化还原、生物甲基化、生物合成等过程会产生多种砷的形态，其在体内的存在形态主要包括四类:无机砷 (亚砷酸盐和砷酸盐)、有机砷小分子 (甲基砷酸、二甲基砷酸)、砷的有机化合物(砷甜菜碱、砷胆碱、乳酸三甲基砷、砷酯及砷糖等)、含砷的生物大分子 (不同价态的砷化物与转铁白蛋白或血红蛋白的结合物)［10］。其中亚砷酸 (As3+)比砷酸 (As5+)更容易与蛋白质中的巯基结合，所以毒性最大，一甲基砷酸 (MMA)和二甲基砷酸 (DMA)只具有中等毒性，而动植物中的砷甜菜碱和砷胆碱几乎无毒性［11］。以总砷为标准，该类中药砷含有量将大大高于限量，是不客观和不合理的。

国内学者对于含雄黄中药可溶性砷总量或其形态研究逐渐增多［12-14］，多采用模拟体内仿生提取法研究人工胃液或人工肠液中可溶性砷及其形态;但对采用其他提取溶剂进行含雄黄中药可溶性砷的研究尚未见报道。含雄黄中药成分复杂，同一处方中其他中药材不仅会影响雄黄中砷在体内的溶出，而且可能会对其中砷的价态产生影响，也可能会形成砷络合物;本实验旨在通过不同提取溶剂和提取方法的研究，采用高效液相色谱 (HPLC)-电感耦合等离子体质谱 (ICP-MS)联用技术同时、快速分析6种砷形态，研究探讨不同提取溶剂中药雄黄及5种不同含雄黄复方制剂中可溶性砷含有量及其形态分布，为含雄黄中药的标准及其限量制订研究奠定了基础。

1 实验部分

1.1 仪器美国Agilent 1100高效液相色谱仪(HPLC);美国Agilent 7500Ce电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS);美国 Millipore超纯水机(Milli-Q);Dionex公司的ASE100型快速溶剂萃取仪;美国CEM微波消解仪。

1.2 试剂及试药

1.2.1 试剂磷酸二氢铵、EDTA均为分析纯;超纯水:电阻率18.2 MΩ/cm;盐酸、硝酸、甲醇均购于德国 Merck 公司;7Li、89Y、140Ce、205Tl调谐液购于美国Agilent公司。

1.2.2 标准溶液砷标准溶液 (1.00 g/L)、亚砷酸根溶液标准物质［(As(Ⅲ)，μmol/g)］、砷酸根溶液标准物质［(As(Ⅴ)，0.233 μmol/g)］、一甲基砷溶液标准物质 (MMA，二甲基砷溶液标准物质 (DMA，CH3CH2AsO2=0.706 μmol/g)、砷胆碱溶液标准物质 (AsC，C5H14AsBrO=0.374 μmol/g)、砷甜菜碱溶液标准物质 (AsB，C5H11AsO2=0.518 μmol/g)购于国家标准物质中心。

1.2.3 标准物质茶叶 (地矿部物化探研究所，GBW10016(GSB-7);金枪鱼 (TUNA FISH TISSUE，BCR-627，Institute for Reference Materials and Measurements)，海藻 (Seaweed，T07129， The Food and Encironment Research Agency)。

1.2.4 试药雄黄药材 (Y1);雄黄炮制品 (水飞)(Y2);七味新消丸 (Y3)、万灵片 (Y4)、牛黄醒消丸 (Y5)、牛黄抱龙片 (Y6)和牛黄消炎片 (Y7)由上海雷允上药业有限公司提供。除雄黄和水飞雄黄外，将其余样品均研细后过九号筛。

2 方法与结果

2.1 ICP-MS及HPLC-ICP-MS测定条件以10 μg/L 的7Li、89Y、140Ce、205Tl调谐液对 ICP-MS 进行调谐，使89Y灵敏度达到最优，同时使75As有较高灵敏度和较低检测限;ICP-MS仪器参数:射频功率1450 W，射频电压1.79 V，载气体积流量1.10 L/min，蠕动泵流速0.1 r/s，氦反应碰撞模式，测定砷总量选择全定量模式;HPLC-ICP-MS工作条件:采用Hamilton PRP-X100(250 mm×4.1 mm，10 μm)阴离子交换色谱柱，以 50 mmol/L NH4H2PO4(pH 8.0)为流动相，ICP-MS选择时间分辨模式，其他条件同ICP-MS仪器参数。

2.2 标准品溶液的制备及线性关系考察

2.2.1 砷标准溶液的制备及线性关系考察精密吸取砷标准溶液适量，用稀释液 (含1%盐酸、2%硝酸和1%甲醇的混合溶液)制成每1 L含砷0、1、5、20、50、100、250 μg的系列溶液，作为测定砷总量和可溶性砷总量的标准曲线。在0～250 μg/L质量浓度范围内，砷元素线性方程为:A=4.010×10－3C+1.021 ×10－4(相关系数 R=0.9996)，线性关系良好。

2.2.2 砷价态标准溶液的制备及线性关系考察精密吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA、AsC和AsB标准物质溶液适量，用0.05 mol/L EDTA溶液制成每 1 L含 As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC和 AsB等不同价态砷 0、5、10、20、50、100、200 μg的系列混合标准溶液。以质量浓度为横坐标，以各待测峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线。6种价态的砷在拟订色谱条件下分离较好 (见图1)，在0～200 μg/L质量浓度范围内线性关系良好 (见表1)。

图1 砷的6种形态分析色谱图Fig.1 Chromatogram for six speciations of arsenic

表1 6种不同价态砷的标准曲线方程Tab.1 Equation of the six different arsenic speciations

2.3 总砷含有量测定精密称取雄黄及水飞雄黄0.05 g、含雄黄中药0.3～0.5 g于微波消解罐中，加入5 mL消解液 (硝酸∶盐酸3∶1)，放置30 min后，将密封罐置于微波消解仪中按既定程序进行消解，若消解不完全则再加入1 mL消解液，继续消解至罐内溶液澄清为止。将消解后样品转移至50 mL聚四氟乙烯量瓶中，定容至刻度，样品溶液以稀释液进行适当稀释，采用ICP-MS测定砷总量。

2.3.1 准确度与精密度取茶叶标准物质0.5 g，按照供试品溶液制备方法制备，以既定方法用ICP-MS测定砷总量，一式6份平均测定结果为0.082 mg/kg，RSD为7.8%;测定结果在标准物质标准范围内 (0.09±0.01)mg/kg，说明测定方法准确度高，精密度好。

2.3.2 样品中总砷含有量 7种雄黄及其复方制剂中总砷的定量分析结果见表2。由表2可见，若以总砷计则均远远超出《中国药典》2010年版一部中规定的中药材允许限量值2 mg/kg。

表2 总砷测定结果Tab.2 Result of total arsenic in samples

2.4 可溶性砷提取方法精密称取雄黄及水飞雄黄0.1 g、含雄黄中药0.5 g，分别用以下方法进行提取。

2.4.1 快速溶剂萃取 (ASE) 精密称取样品于不锈钢萃取池中。萃取程序如下:萃取时间为平衡5 min，重复2次;萃取温度为100℃;萃取溶剂为甲醇/水 (V/V，1∶1);萃取压力为1500 psi(1 psi=6.895 kPa)。萃取液在40℃水浴中旋转蒸发近干，残渣用超纯水溶解，恒定质量至10 g，即得。

2.4.2 甲醇超声提取精密称取样品于50 mL具塞离心管中，加入10 mL甲醇－水 (V/V，1∶1)冰浴超声60 min，然后置于离心机中以5000 r/min旋转30 min，精密吸取上清液5 mL，在40℃水浴中旋转蒸发近干，残渣用超纯水溶解，定质量至10 g，即得。

2.4.3 0.16%盐酸超声提取精密称取样品于50 mL具塞离心管中，精密加入10 mL 1%盐酸(V/V)溶液，混匀，冰浴超声60 min，然后置于离心机中以5000 r/min旋转30 min，取上清液即得。

2.4.4 模拟人工胃液振荡提取精密称取样品于50 mL具塞离心管中，精密加入10 mL人工胃液，混匀，置于摇床上，控制温度37℃，振摇4 h。冷却，然后置于离心机中以5000 r/min旋转30 min，取上清液即得。

以上样品溶液均过0.22 μm的滤膜，取续滤液按砷形态分析方法测定不同提取条件下可溶性砷形态;样品溶液经稀释液稀释后，按照砷总量测定条件测定不同提取条件下可溶性砷总量。

2.5 可溶性砷准确度及精密度取标准物质金枪鱼0.5 g含砷甜菜碱 (3.9±0.225)mg/kg，二甲基砷 (0.15±0.0225)mg/kg，及海藻0.1 g含无机砷［As(Ⅲ)和As(Ⅴ)］86～118 mg/kg。按照可溶性砷的提取方法提取，分别测定标准物质中有机砷和无机砷的价态，各一式6份，用以可溶性砷准确度和精密度试验。结果见表3，表4。

结果表明，不同提取方法的有机砷 (金枪鱼)和无机砷 (海藻)提取结果均在标准值范围内; 方法重复性RSD均小于10%。

表3 标准物质金枪鱼中有机砷价态的准确度及精密度试验Tab.3 Accuracy and reproducibility of the organic arsenic in standard substance(tuna fish)

表4 标准物质海藻中不同价态砷准确度及精密度试验Tab.4 Accuracy and reproducibility of the inorganic arsenic in standard substance(Seawead)

2.6 可溶性砷总量及形态的测定

2.6.1 可溶性砷总量将2.4.1项～2.4.4项的样品溶液经一定比例稀释后，按照砷总量测定条件采用ICP-MS测可溶性砷总量，结果见表5。将不同提取方法的可溶性砷总量与各样品中所含总砷量进行比较 (见表6)，结果表明可溶性砷的量仅占总砷量的0.10%～2.70%。

表5 可溶性砷总量结果Tab.5 Results of total soluble arsenic

表6 可溶性砷总量与总砷含有量百分比Tab.6 Total soluble arsenic in the percentage of the total arsenic

2.6.2 可溶性砷的形态分析将2.4.1项～2.4.4项的样品溶液按照既定条件进行测定，考察不同提取溶剂提取出可溶性砷的形态 (见图1～2)。将测得的形态含量总和与各样品总砷量及可溶性砷总量进行比较，结果发现:不同方法提取出的砷价态均仅有三价砷［As(Ⅲ)］和五价砷［As(Ⅴ)］两种价态，结果见表7～8。

图2 样品中可溶性砷形态分析色谱图Fig.2 Chromatogram for the speciation of the soluble arsenic in the sample

2.7 不同砷价态的检测限以5 μg/L的不同价态砷标准混合溶液进样分析，计算各峰信噪比，并换算至3倍信噪比，作为不同砷价态的检测限，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、DMA、MMA、AsC、AsB的检测限分别为 2.4、2.6、2.5、2.7、1.8、0.9 μg/L。

3 讨论

3.1 可溶性砷不同提取溶剂和方法比较研究砷形态分析中常用酸性溶剂提取毒性较大的无机砷，另外甲醇-水 (1∶1)也是常用的砷形态提取溶剂，该溶剂可提取砷的无机和有机形态［15］。含雄黄中药口服后经胃液消化再进入体内，因此许多学者应用仿生手段模拟人工胃液提取可溶性砷，本课题除研究模拟人体条件下提取的可溶性砷外，还结合0.16%盐酸溶液，甲醇-水 (1∶1)等不同提取溶剂采用水浴振荡、超声等不同提取方法，对含雄黄中药中可溶性砷形态进行全面研究，采用无机砷和有机砷标准物质进行方法学研究表明，方法准确度和精密度良好。

表7 可溶性砷的形态测定结果Tab.7 Results of the speciation of the soluble arsenic

表8 可溶性砷形态与总砷量、可溶性砷总量比较Tab.8 Comparison of total arsenic and total soluble arsenic with the speciation of the soluble arsenic

由表5结果可知采用人工胃液振荡提取、0.16%盐酸溶液超声提取，其提出的可溶性砷量基本相当，因此在模拟人体研究中采用超声方法代替振荡，显著提高效率。选用甲醇-水 (1∶1)为溶剂进行超声及快速溶剂萃取结果发现:雄黄及含雄黄中成药经酸液和甲醇提取后，均仅有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)两种价态，未发现含有砷胆碱、砷甜菜碱、一甲基砷和二甲基砷。As(Ⅲ)和As(Ⅴ)是毒性较大的两种砷形态，但在中药复方中也是起疗效的两种形态［14］，因此有必要对其进行深入研究，拟订适当的限量，完善该类药物的质量控制，以保证用药安全有效。

表5结果中雄黄和水飞雄黄可溶性砷的量相差约5倍，可能与雄黄经水飞后其粒度非常细小，可溶性砷随之增加;该现象与传统观念认为水飞工艺是减少可溶性砷的观念有较大差异，但与目前通过减小雄黄粒度采用新型纳米雄黄制剂治疗血液系统疾病的原理一致［16］，说明雄黄经水飞的目的并非降低其可溶性砷的量，本课题组的相关研究表明雄黄经水飞后，其伴生元素如铅、铁等含量大大降低，可能是雄黄经炮制后降低毒性的原因之一。

3.2 不同制剂中雄黄可溶性砷形态比较模拟人体环境提取可溶性砷中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和与可溶性砷总量结果比较显示，雄黄药材及其炮制品中两者接近，但在含雄黄中成药两者因品种不同而差别较大，有些制剂中检测到As(Ⅲ)和As(Ⅴ)之和仅为可溶性砷总量的53.98%(见表8)，说明雄黄单独口服在体内溶出的只有As(Ⅲ)和As(Ⅴ)，雄黄的复方制剂中其他成分使溶出的砷形态发生转化，但并未形成目前已知6种价态的砷，推测形成其他砷大分子复合物，这类砷复合物是否能被人体吸收或者可降低其对人体的毒性，有待进一步深入研究。

表8中采用有机溶剂甲醇-水提取的可溶性砷As(Ⅲ)和As(Ⅴ)均高于模拟体内结果，推测有机溶剂提取过程一些有机价态的砷或砷复合物被提取，而后转化为As(Ⅲ)或As(Ⅴ)，具体转化如何发生还有待进一步研究。

3.3 含雄黄制剂可溶性砷限量探讨雄黄及其中药复方制剂中砷的总量远远超过了国际上规定的人日摄入砷量的标准，但采用人工胃液提取的酸可溶性砷仅为其总量的0.13%～2.7%，表9根据各样品服用量并结合其处方量及上述实验结果，计算酸可溶性砷日摄入量。结果表明，大多数样品酸可溶性总砷的摄入量小于食品添加剂联合专家委员会(JECFA)的安全限量 (0.128 mg/(人·d－1)，但也有3个样品超出该限量，其酸可溶性砷中As(Ⅲ)+As(Ⅴ)的日摄入量小于酸可溶性总砷日摄入量。