HPLC同时测定不同产地滇重楼中的6种重楼皂苷

2012-07-26赵庭周杨永红韦建荣

中成药 2012年1期

李懿，何佳，赵庭周，杨永红，苏豹，马青，韦建荣*

(1.云南白药集团股份有限公司，云南昆明650032;2.云南农业大学植物保护学院，云南昆明650201)

滇重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.的干燥根茎，极具药用价值，主要分布在我国滇、川地区，具有清热解毒、消肿止痛、平喘止咳、凉肝定惊之功效，多用于疔疮痈肿、咽喉肿痛、虫蛇咬伤、跌打伤痛等症［1-2］。现代化学研究，已从重楼属植物中分离鉴定出50余种化合物，其中主要成分为甾体皂苷类，约占总化合物数目的80%，并含有甾醇、甾醇苷、黄酮苷、C21孕甾烷型苷等。甾体皂苷是其主要活性成分，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元［4-8］。本研究中重楼皂苷Ⅵ，Ⅶ，PA，H 属于偏诺皂苷，重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ属于薯蓣皂苷［2-3］，目前文献对重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ研究较多，对重楼皂苷PA，H的研究相对较少。现代药理研究表明，重楼属药材具有抗肿瘤、抗菌消炎、止血、镇静镇痛、抑制精子活性、抗细胞毒、免疫调节等广泛的药理活性［9］。

由于滇重楼繁殖率低，其传统药用部位根茎的自然生长速度十分缓慢，从种子生长为药用商品，一般需10～15年，野生重楼资源再生较慢。近年来随着药用范围不断扩大，对商品药材需求量逐年增加，现有药源远不能保障市场需要，仅靠野生资源已不能满足工业化生产，加之主产区乱采滥挖，忽视对滇重楼资源的保护和繁育，野生种质资源遭到严重破坏，逐年的大量采挖已使野生滇重楼资源日趋枯竭，从而诱发滇重楼价格不断攀升，在此情况下，摸清目前滇重楼资源情况具有重要意义;通过走访滇重楼的传统产区，实地采集标本，收集样品，对不同产地的滇重楼资源进行质量评价，全面掌握目前滇重楼资源状况，为有效保护和合理利用滇重楼资源收集资料并提供科学依据。

1 药材与试剂

1.1 药材来源分析样品产自云南省境内13个州(市、地区)，涉及约75个采集点，采集重楼属植物植株292株，所有标本具有标签及原植株生境照片，同时记录来源、生境、气候、地形、土壤、植被、海拔等相关信息，资料现收藏于云南白药研究院;共获得分析样品69份，样品经云南白药集团股份有限公司赵庭周工程师、云南农业大学杨永红教授鉴定，其中56份为重楼属药用植物滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis。

1.2 仪器与试剂高效液相色谱仪(Agilent 1100)，自动进样器，DAD检测器。乙腈为色谱纯，水为三蒸水。重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ对照品购自中国药品生物制品检定所(批号 111590-200402，111591-200402，111592-200402，111593-200402);重楼皂苷PA，H对照品，购于中国科学院昆明植物研究所。

2 方法与结果

2.1 样品处理新鲜植株采集后除去泥沙等杂质，取根茎，减压下40℃烘干，粉碎，细粉分包密闭后－20℃保存备用。

2.2 定量测定

2.2.1 色谱条件 Agilent SB-C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm);流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，0～10 min，5% ～20%A，10～50 min，20% ～42%A，50～90 min，42% ～80%A，90～100 min，80%～95%A，洗脱时间为100 min;检测波长203 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2.2 线性关系分别取在40℃下减压干燥的重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H对照品适量，精密称定，用甲醇制成0.4 mg/mL的对照品溶液，分别进样4、8、12、14、16、20 μL，得到回归方程为:AⅠ=561.18 CⅠ+16.2，r=0.9998;AⅡ=539.73CⅡ+14.4，r=0.9994;AⅥ=645.0.7CⅥ+13.2，r=0.9992;AⅦ=462.4CⅦ+19.8，r=0.9995;APA=603.16CPA+20.1，r=0.9997;AH=617.69CH+14.6，r=0.9993。

2.2.3 精密度、稳定性、重复性、回收率试验 6种重楼皂苷的精密度、稳定性、重复性的RSD范围分别为 0.97% ～ 1.32%，1.34% ～ 1.69%，1.17% ～1.52%，表明精密度、稳定性、重复性良好;重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H 加样回收率分别为:98.73%，98.17%，98.86%，98.01%，98.92%，98.33%，加样回收率的 RSD范围分别为 1.01% ～1.37%，0.74% ～ 1.21%，1.07% ～ 1.44%，1.15% ～1.68%，0.94% ～1.56%，1.33% ～1.82%。

2.2.4 样品测定对照品溶液和供试品溶液的制备按2010年版《中国药典》一部重楼药材项下含量测定的有关规定进行，色谱图见图1;每份样品平行测定3次，结果取均值，各样品重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ，PA，H测定的 RSD范围分别为 1.43% ～1.88%，1.52% ～1.95%，1.23% ～1.92%，1.51%～2.16%，1.62% ～ 1.91%，1.68% ～2.07%，测定结果见表1。

图1 6种重楼皂苷对照品及香格里拉维西县永春乡四保1号样色谱图Fig.1 The HPLC chromatogram of six Paris polyphylla var.yunnanensis.for standard and sample

3 讨论

3.1 按照样品产地和样本量情况，以地理区域进行归类合并，对偏诺皂苷量(重楼皂苷Ⅵ，Ⅶ，PA及H之和)、薯蓣皂苷量(重楼皂苷Ⅰ，Ⅱ之和)以及6种皂苷量之和进行比较。综合来看，滇东南地区(红河州)、滇西北地区(香格里拉、怒江、丽江)的样品偏诺类皂苷量较高，滇西地区(大理州)样品的薯蓣皂苷量较高，6种皂苷量之和较高地区为大理、红河、滇西北、滇西地区及滇中地区(楚雄州)的部分区域，而滇南地区(西双版纳)重楼样品的3个指标较其他地区略低，这可能与这些地区特殊的气候、自然地理条件导致植株生长速度较快有关。

3.2 从实验数据可看出，测定的56个样品中，测出重楼皂苷Ⅰ的50个，占样品总数89.29%，测出重楼皂苷Ⅱ的51个，占样品总数91.07%，测出重楼皂苷Ⅵ的3个，占样品总数5.36%，测出重楼皂苷Ⅶ的54个，占样品总数96.43%，测出重楼皂苷H的52个，占样品总数92.86%，测出重楼皂苷PA的31个，占样品总数55.36%;结果表明，各地所产滇重楼，重楼皂苷含有量差异很大，同时，从数据也可看出，各地所产滇重楼的6种重楼皂苷之间质量分数波动并无显著性规律，呈现为随机波动，但同一区域(地域)所产重楼，其各类皂苷量有一定的可比性及相似的变化规律，说明皂苷量与产地、生长环境等因素关系密切，邹亮等［10］曾对不同产地滇重楼不同部位的4种重楼皂苷平均质量分数分布状况进行

研究，结果表明滇重楼的品质表现出一定的地域和生境依赖性，且各部位重楼皂苷的平均质量分数也存在明显差异，因此实施中药材GAP管理，重视和发展地道药材，规范地道药材的种植，具有重要的现实意义和必要性;同时加强生物量优势品种与皂苷量优势品种的杂交育种研究，培育新的、经济价值更高的栽培种，是有效保护和合理利用滇重楼资源的可行途径。