miRNA181a在肝细胞癌中的表达及其临床意义

夏永欣，张金平

1.南阳市中心医院消化内科二病区，河南南阳473009;2.郑州大学第一附属医院消化内科

在世界范围内，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发病率位于肿瘤发病率第5位，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中占第3位［1-3］。HCC死亡率已占我国恶性肝病死因的第2位，在农村中则为第1位。miRNA是近年来发现于真核细胞中的一类内源性非编码小分子RNA，长约21～22个核苷酸，可通过与靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)或5'UTRs近乎完全互补结合在转录后水平使其降解，或者与之不完全互补结合在翻译水平抑制蛋白合成，从而在基因表达中发挥重要的调节作用［4-5］。

我们新近研究发现恶性程度较低的Hep3B细胞与侵袭力更强的HepG2细胞相比较:miRNA181a表达明显上调。本研究检测肝细胞癌、癌旁组织和正常肝组织中miRNA181a的表达水平，探索分析miRNA181a表达异常与肝细胞癌病理学特征如肿瘤大小、肿瘤分化程度、临床分期、是否合并肝硬化、血AFP浓度等的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集南阳市中心医院及郑州大学第一附属医院普外科2010年5月－2011年5月手术切除HCC标本30例，癌旁组织取自距离癌组织2 cm的肝脏组织，所有病例均经病理证实。其中男22例、女8例，平均年龄(50±10.60)岁。术中、术前均未经放、化疗及免疫治疗。另取来源于肝血管瘤患者的正常肝组织10例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及质量检测:按照TRIzol®试剂(Invitrogen life technologies)说明书的步骤，逐步提取出组织标本中的总RNA。应用紫外分光光度计测定总RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值计算其浓度，并计算A260/A280值检测其纯度。

1.2.2 实时定量PCR检测目的miRNA表达量:取2 μg总RNA作为初始模板，总反应体系为20 μL，应用miScript Reverse Transcription Kit说明书进行逆转录合成cDNA，反应条件为:37℃，60 min;95℃，5 min。然后取1 μL上述cDNA为模板，以U6 SnRNA作为内参照，每个检测样本做3个复孔，在Rotor-Gene 3000 Real-time PCR仪(Corbett Research)上进行实时定量PCR，反应条件为:95℃预热15 min;95℃，10 s;58℃，30 s;72℃，30 s，35个循环;实验中所用引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 统计学分析 采用内参基因U6 SnRNA标化、计算每一种被检miRNAs的△Ct值。应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，组间比较采用t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌组织中miR-181a基因表达量的比较与癌旁组织相比，30例HCC组织中有13例miR-181a基因表达上调，占43.33%(13/30)，17例表达下调，占56.67%(17/30)，两组相比，差异有统计学意义。与正常肝脏组织相比，30例HCC组织中有23例miR-181a基因表达下调，占76.67%(23/30);7例表达上调，占23.33%(7/30)。miR-181a基因在HCC组织中的表达量低于正常肝组织(P＜0.01)。肝癌组织中miR-181a与癌旁组织相比无显著性差异(P＞0.05);与正常组织相比具有显著性差异(P＜0.01，见图1)。

图1 miR-181a相对表达量 HCC:肝癌组织;NT:癌旁组织;NL:正常肝组织Fig 1 The relative expression of miR-181a in different liver tissues

2.2 miR-181a基因表达相对倍数与肿瘤病理学特征的关系 miR-181a表达下调与临床分期、HCC分化程度和合并肝硬化明显相关(P＜0.05)。而miR-181a基因表达上调与肝细胞癌的大小、血AFP浓度、是否并发HBV感染均无明显相关性(P＞0.05，见表1)。

3 讨论

表1 miR-181a基因表达相对倍数与肿瘤病理学特征的关系Tab 1 The relationship of the miR-181a expression and pathological characteristics of HCC

研究表明，在多种肿瘤中存在miRNA的异常表达;此外亦发现miRNA的靶基因中有许多作用于肿瘤相关的信号转导通路，提示miRNA与肿瘤发生及转移有密切的关系［6-7］。目前研究已表明miRNA参与了HCC的发生及转移过程［8-11］。许多基础和临床研究认为miRNAs可能是一组新的致癌基因或抑癌基因。miRNAs既可作为抑癌基因，下调原癌基因的活性;也可作为癌基因，下调抑癌基因的活性。我们实验室前期的研究发现，miR-181a能在体外培养的肝癌细胞中调节骨桥蛋白依赖的肝癌转移［12］。Frueht等［13］用弗斯可林(forskolin)处理内耳细胞，检测基因表达变化，发现miR-181a表达变化，功能实验显示miR-181a能促进听毛细胞的增殖。最近的研究显示miR-181a能与凋亡相关的mRNA Bim靶相结合，抑制套细胞淋巴瘤或非Hodgkin淋巴瘤细胞的化疗相关的凋亡，从而抑制淋巴瘤细胞对化疗药的敏感性［14］。本研究从临床标本水平，研究miR-181a在肝癌组织中的表达量与肿瘤病理学特征的关系，结果发现癌组织与癌旁组织及正常组织相比，miR-181a表达显著下调。我们研究结果进一步发现肝细胞癌miR-181a表达量与肿瘤分化程度、临床分期和合并肝硬化明显相关。究其详细机制尚不十分清楚。推测可能由于miR-181a作用于转录因子EZF家族，进一步促使癌细胞从G1期向S期的转变，促进细胞增殖，抑制细胞分化。目前还没有miR-181a表达与肝细胞癌肿瘤病理学特征的关系方面的研究报道。miR-181a的作用机制值得进一步深入研究。

［1］ El-Serag HB，Rudolph KL.Hepatocellular carcinoma:epidemiology and molecular carcinogenesis［J］.Gastroenterology，2007，132(7):2557-2576.

［2］ Padma S，Martinie JB，Iannitti DA.Liver tumor ablation:percutaneous and open approaches［J］.J Surg Oncol，2009，100(8):619-634.

［3］ Cha CH，Saif MW，Yamane BH，et al.Hepatocellular carcinoma:current management［J］.Curr Probl Surg，2010，47(1):10-67.

［4］ Pillai RS.MicroRNA function:multiple mechanisms for a tiny RNA?［J］.RNA，2005，11(12):1753-1761.

［5］ Miranda KC，Huynh T，Tay Y，et al.A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes［J］.Cell，2006，126(6):1203-1217.

［6］ Schmittgen TD.Regulation of microRNA processing in development，differentiation and cance［J］.J Cell Mol Med，2008，12(5B):1811-1819.

［7］ Deng S，Calin GA，Croce CM，et al.Mechanisms of microRNA deregulation in human cance［J］.Cell Cycle，2008，7(17):2643-2646.

［8］ Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN.Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，48(6):2047-2063.

［9］ Thorgeirsson SS，Lee JS，Grisham JW.Functional genomics of hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology，2006，43(2 Suppl 1):S145-S150.

［10］ Budhu A，Jia HL，Forgues M，et al.Identification of metastasis-related microRNAs in hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology，2008，47(3):897-907.

［11］ Ji J，Wang XW.New kids on the block:diagnostic and prognostic microRNAs in hepatocellular carcinoma ［J］.Cancer Biol Ther，2009，8(18):1686-1693.

［12］ Bhattacharya SD，Garrison J，Guo H，et al.Micro-RNA-181a regulates osteopontin-dependent metastatic function in hepatocellular cancer cell lines［J］.Surgery，2010，148(2):291-298.

［13］ Frueht CS，Uduman M，Duke JL，et al.Gene expression analysis of Forskolin treated basilar papillae identifies mieroRNA-181a as a mediator of proliferation［J］.PLoS One，2010，5(7):e11502.

［14］ Lwin T，Lin J，Choi YS，et al.Follieular dendritic cell-dependent drug Resistance of non-Hodgkin lymPhoma involves cell adhesion-mediated Bim Down-regulation through induction of microRNA-181a［J］.Blood，2010，116(24):5228-5236.