珍珠菜抗肿瘤有效部位ZE4对肝癌Bel-7402细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

王 丽，虞 莹，龙林梅，张庆青，唐丽华，梁中琴

(苏州大学药学院药理学系，江苏 苏州 215123)

珍珠菜(Lysimachia clethroides Duby)为报春花科植物虎尾珍珠菜的根或全草，性平味辛涩，主要作用是活血调经，利水消肿［1］。研究表明，从珍珠菜全草中提取得到的抗肿瘤有效部位ZE4的主要成分为总黄酮苷，对小鼠宫颈癌U14实体瘤［2］、小鼠白血病 L1210［3］、小鼠肝癌H22［4］、人白血病HL-60［5-6］和K562 细胞［5，7］等均有抑制作用，但未见有关其对肝癌Bel-7402细胞裸鼠移植瘤抑制作用的报道。本研究观察珍珠菜抗肿瘤有效部位ZE4对肝癌Bel-7402细胞裸鼠移植瘤抑制作用及移植瘤组织中细胞凋亡和血管生成的影响，为其用于肝癌治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、试剂和仪器

5周龄雄性裸鼠BALB/c nu，体质量18～22 g，购自爱尔麦特科技有限公司，动物许可证号:SYXK(苏)2007-0035。肝癌Bel-7402细胞由苏州大学肿瘤药理实验室保存，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，置于37℃，5%CO2恒温培养箱内，用0.25%胰蛋白酶消化液消化传代。2.5%5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)注射液购自上海旭东海普药业有限公司;兔抗人Bax抗体和鼠抗人Bcl-2抗体购自Millipore公司;鼠抗人β肌动蛋白抗体和兔抗鼠CD34抗体购自Abcam公司;荧光标记山羊抗鼠IgG二抗和山羊抗兔IgG二抗购自美国Gaithersburg公司;DAB显色试剂盒(SK-4105)购自Vector Laboratories公司;其他试剂均为国产分析纯。HeraeusBB16UV型 CO2培养箱，德国 Heraeus公司;Eclipse TE2000-U型倒置荧光显微镜，日本Nikon公司;JY96-1Ⅰ型超声细胞破碎仪，宁波科生仪器厂;垂直电泳槽和转移电泳槽，Bio-Rad公司;BCM-1000A型生物洁净工作台，苏净安泰有限公司;Odyssey型双色红外激光成像系统，美国基因有限公司。

1.2 珍珠菜抗肿瘤有效部位ZE4的制备

珍珠菜药材由苏州雷允上药材采购站提供，经苏州大学药学院刘春宇教授鉴定为虎尾珍珠菜全草。珍珠菜抗肿瘤有效部位ZE4为采用药物活性跟踪法进行体外筛选得到的抗肿瘤有效部位［8］，主要成分为总黄酮苷，由苏州大学植物化学实验室提供(批号:2005071201);以芦丁作为对照品，采用紫外分光光度法测定ZE4中总黄酮含量，总黄酮含量为33.3%［9］。每天ig给药时用灭菌蒸馏水溶解成适当浓度给药。具体制备工艺如下:取经粉碎的珍珠菜药材适量，依次加入12，10和8倍量的80%乙醇，加热回流提取，每次1.5 h，合并提取液，过滤。滤液减压回收溶剂，并浓缩至含生药500 g·L-1。浓缩液加2倍体积水稀释，静置，抽滤除去不溶性物质，滤液再次浓缩，即得珍珠菜上样液，提取液回收乙醇，浓缩成浸膏(1 g浸膏相当于3 g生药)，真空干燥即得。

1.3 动物分组、给药及瘤质量和瘤体积的测定

65只5周龄裸鼠于右侧腋下皮下接种Bel-7402细胞，每只1.0×107细胞。测量肿瘤体积V(mm3)=0.5 × a×b2〔a:肿瘤的长径(mm)，b:肿瘤的短径(mm)〕。接种 15 d后测得肿瘤平均体积约120 mm3，选取肿瘤体积在80～140 mm3的裸鼠40只，根据裸鼠体质量和肿瘤体积随机分为模型(ig给予灭菌蒸馏水)、ZE4100、200 和400 mg·kg-1及5-FU 20 mg·kg-1组，每组8只。分组当天即开始给药，ZE4组裸鼠每天ig给药1次，5-FU组裸鼠隔日ip给予5-FU 1次;给药体积均为10 ml·kg-1，连续21 d。每3 d称体质量并测量肿瘤体积。给药21 d后处死裸鼠，剥离肿瘤组织称瘤质量并储存备用。抑瘤率(%)=(1-ZE4组瘤质量/模型组瘤质量)×100%，根据体积绘制肿瘤生长曲线。

1.4 Western印迹法测定移植瘤组织Bax和Bcl-2蛋白表达

移植瘤组织剪碎后加入裂解液超声制备50%的组织匀浆，离心得上清，用BCA试剂盒测蛋白质浓度后稀释至等蛋白质浓度，加入5×上样缓冲液变性5 min，上样量为每孔160 μg，重复上样3次(n=3)，用10%SDS-PAGE胶分离蛋白后转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入抗Bax(1∶2000)，Bcl-2(1∶1000)和 β 肌动蛋白(1∶600)抗体，4℃过夜后，含Bax的PVDF膜加入荧光标记山羊抗兔IgG二抗(1∶10000)，含 Bcl-2和 β 肌动蛋白的PVDF膜加入荧光标记山羊抗鼠IgG二抗(1∶10000)孵育1 h，测定各蛋白条带的荧光强度并转换为黑白照片，利用SigmaScan Pro 5软件分析各蛋白条带的积分吸光度(integrated absorbance，IA)值。

1.5 免疫组织化学法测定移植瘤组织中血管生成

制备移植瘤组织冰冻切片(5 μm)，用3%H2O237℃孵育30 min，PBS冲洗2次，每次5 min;用2.5%正常马血清工作液于37℃封闭20 min，倾去封闭工作液(勿洗)，分别加兔抗鼠CD34抗体(一抗)(1∶50)，以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜，PBS冲洗2次，每次5 min;加生物素标记山羊抗兔IgG抗体(二抗)(1∶500)孵育30 min，PBS冲洗2次，每次 5 min;加入 ABC工作液 37℃孵育30 min，PBS冲洗2次，每次5 min;DAB染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染1～2 min，盐酸乙醇中脱色后自来水浸洗，常规脱水，干燥，封片，光镜下观察。在低倍视野下(×40)选取移植瘤组织内CD34阳性血管分布最密集区域，在高倍镜下(×100)分别选择5个CD34阳性血管分布密集区域，计数CD34阳性血管即微血管数目，用1 mm2的微血管绝对数表示，求其平均值作为该组织的微血管密度(microvessel density，MVD)［10］。每个被染成棕黄色、可与周围血管、肿瘤细胞及其他结缔组织分开的内皮细胞或内皮细胞簇，无论有无管腔形成和红细胞出现，均被视为一个微血管［11］，分辨不清或染色模糊的细胞不计。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 ZE4对肝癌Bel-7402细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

由表1看出，给药21 d后，ZE4200 mg·kg-1和阳性对照5-FU组移植瘤质量较移植瘤模型组明显减小(P ＜0.05)，抑瘤率分别为 52.1% 和 47.9%;ZE4100和400 mg·kg-1对移植瘤质量无明显影响。移植瘤生长曲线见图1，模型组肿瘤体积逐渐增大，给药21 d后达(2.90±0.89)cm3，ZE4和5-FU 组裸鼠移植瘤体积增长较为缓慢，其中 ZE4200 mg·kg-1组从14 d后开始与模型组相比明显减小(P＜0.05)，5-FU组在21 d与模型组相比减小(P ＜0.05);ZE4100 和400 mg·kg-1组无明显变化。提示ZE4200 mg·kg-1可抑制肝癌Bel-7402细胞移植瘤生长。

Tab.1 Effect of antitumor effective part ZE4 of Lysimachus clethroides Duby on tumor mass of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice

Fig.1 Effect of ZE4 on tumor volume of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice.See Tab.1 for mice treatments.，n=8.*P＜0.05，compared with model group.

2.2 ZE4对裸鼠移植瘤组织Bax和Bcl-2表达的影响

由表 2和图 2可见，与模型组比较，ZE4200 mg·kg-1和5-FU组 Bax蛋白条带 IA值增加，Bcl-2蛋白条带 IA值降低，Bax/Bcl-2增加(P＜0.01);ZE4100 和400 mg·kg-1组 Bax/Bcl-2 无明显变化;提示Bcl-2家族介导的凋亡途径可能参与了ZE4的抗肿瘤作用。

Fig.2 Effect of ZE4 on expression of Bax and Bcl-2 in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice by Western blotting.See Tab.1 for mice treatments.Lane 1:model;lane 2，3 and 4:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1，respectively;lane 5:5-FU 20 mg·kg-1.

2.3 ZE4对裸鼠移植瘤血管生成的影响

免疫组织化学染色结果(图3，图4)表明，ZE4100～400 mg·kg-1组 MVD 计数分别为 31.3 ±1.3，13.5 ±1.0 和(20.7 ±1.6)mm-2，5-FU 20 mg·kg-1组为(13.5 ±2.8)mm-2较模型组(42.3 ±2.5)mm-2明显减少(P ＜0.01)，ZE4200 mg·kg-1组较ZE4100 和400 mg·kg-1组相比更加明显(P ＜0.01)，提示ZE4 还可能通过抑制新生血管形成抑制移植瘤生长。

Tab.2 Effect of ZE4 on expression of Bax and Bcl-2 in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice

Fig.3 Effect of ZE4 on angiogenesis in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice(Immunostaining ×100).See Tab.1 for mice treatments.The black arrow means blood vessels with positive CD34 staining.A:model group;B-D:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1groups，respectively;E:5-FU 20 mg·kg-1group.

Fig.4 Effect of ZE4 on microvessel density(MVD)in tumor tissue of Bel-7402 cell xenografted hepatoma in nude mice.See Tab.1 for mouse treatments.1:model group;2-4:ZE4100，200 and 400 mg·kg-1groups，respectively;5:5-FU 20 mg·kg-1 group.，n=5.＊＊P＜0.01，compared with model group;##P＜0.01，compared with ZE4200 mg·kg-1group.

3 讨论

肝癌是一种高度恶性的肿瘤，手术是主要的治疗手段，但多数患者发现时已是晚期，失去了最佳手术时机，而放化疗等其他方法疗效均不理想，所以，中医药治疗成为多数患者不可缺少的辅助治疗手段。本研究结果显示，ZE4200 mg·kg-1对裸鼠Bel-7402肝癌移植瘤生长具有抑制作用，抑瘤率达52.1%。

细胞凋亡是在基因调控下的程序性死亡，凋亡途径受阻在肿瘤发病机制中也发挥重要作用，诱导细胞凋亡是当今肿瘤治疗的热点。Bcl家族是重要的凋亡调控基因，与肿瘤的发生、发展和预后有密切联系。其中促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2经转录表达后的Bax/Bcl-2比值决定凋亡的敏感性［12］。有研究显示，肝癌细胞和组织中均有Bax和Bcl-2的表达，且Bax水平和Bax/Bcl-2二聚体明显低于正常肝组织，而Bcl-2水平明显高于周围正常肝组织，这些蛋白的表达可能与调控肝癌发生有关［13］。本研究通过测定参与肿瘤凋亡途径的蛋白含量来检测细胞凋亡，发现 ZE4200 mg·kg-1组Bax/Bcl-2值明显升高，即凋亡敏感性增加，表明ZE4在体内可通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

血管生成在恶性肿瘤的生长、浸润和转移中均发挥重要作用，目前抑制血管生成可作为治疗恶性肿瘤的手段之一。MVD被认为是反映肿瘤血管生成及肿瘤浸润和转移能力的指标［14］。CD34作为血管内皮细胞标志物具有较高的抗原特异性和稳定性，被认为是最敏感的内皮细胞标志物［15］。应用CD34标记形成血管的再生上皮细胞，检测肿瘤内微血管，是目前测定MVD的良好指标［16］。肝癌是一类富血供的肿瘤，肿瘤血管生成现象尤为典型，CD34染色可将其清晰地显示出来［17］。本研究结果显示，ZE4200 mg·kg-1组MVD与模型组相比明显降低，表明ZE4还可通过抑制血管生成发挥抗肿瘤作用。

本研究通过制备Bel-7402肝癌荷瘤裸鼠模型，以不同浓度ZE4干预治疗21 d，给药期间各组小鼠均未出现死亡、饮食减少和行动迟缓等现象。给药期间监测移植瘤体积，结果显示，ZE4200 mg·kg-1在给药14 d后即可明显抑制裸鼠移植瘤生长，5-FU在给药21 d后抑制移植瘤生长，ZE4100和400 mg·kg-1对移植瘤生长无明显抑制作用。给药结束后称量各组移植瘤瘤质量并计算抑瘤率，ZE4200 mg·kg-1组瘤质量为(1.5 ±0.5)g ，与模型组(3.2 ±1.0)g相比明显减小，抑瘤率达52.1%，且裸鼠体质量并无明显变化，ZE4100和400 mg·kg-1组移植瘤瘤质量无明显变化。对剥离的肿瘤组织进行表型分析，结果显示，ZE4100，200 和400 mg·kg-1均可明显抑制肿瘤血管生成，以200 mg·kg-1组尤为明显，且ZE4200 mg·kg-1在抑制肿瘤血管生成的同时还可提高细胞凋亡敏感性，促进移植瘤细胞凋亡，ZE4100和400 mg·kg-1对移植瘤细胞凋亡则无明显作用。ZE4对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响及对MVD的影响呈非剂量依赖性，与其对移植瘤体积生长的抑制作用和瘤质量的影响一致，推测在肿瘤细胞凋亡调控和血管生成过程中，ZE4200 mg·kg-1均较100和400 mg·kg-1更能有效调节凋亡相关蛋白表达和血管生成，从而抑制移植瘤的生长，目前对造成这一现象的具体原因仍有待进一步研究。

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