激光辅助孵出对冻融胚胎着床潜能的影响

天津市中心妇产科医院生殖医学中心（天津300100） 杜湧瑞 张云山 姚汝强 罗海宁 鲁振宇 王毅娜

辅助孵化（AH）是对移植前胚胎透明带施行人工开口或削减其厚度，使胚胎更易孵出的方法。目前，激光辅助孵化以其简便、准确、有效等特点逐渐被应用于人类辅助生殖技术［1］。胚胎在冻融程序中暴露于极低的温度可能会加速透明带的硬化，使胚胎发育为囊胚后不能孵出而影响着床，这可能是导致冻融胚胎临床妊娠率低于新鲜胚胎的原因之一［2］。有报道认为，对冻融后胚胎进行辅助孵出有助于提高临床妊娠率［3］。本研究旨在排除子宫内膜、胚胎质量等因素探讨激光辅助孵出（LAH）对冻融胚胎着床潜能的影响。

资料与方法

1 一般资料 选取2009年3月至2010年12月期间曾在我院生殖医学中心接受常规IVF或ICSI治疗的不孕患者行冷冻胚胎－解冻移植病例。入选条件为：年龄在23～43岁，基础血FSH值正常（3～12IU/L），在治疗期间无盆腔感染病史，子宫内膜厚度≥8 mm，前次解冻移植胚胎质量好（移植2个或2个以上无损伤Ⅰ～Ⅱ级胚胎）而未妊娠者，与本中心签署知情同意书。入选病例共116个周期，其中56例冷冻胚胎－解冻移植后行激光辅助孵出，作为LAH组；同期60例行常规冷冻胚胎－解冻移植作为对照组。

2 冻融胚胎移植 ①胚胎冷冻：分裂期胚胎进行评分［4］，Ⅰ级：细胞大小均匀，形状规整，碎片0～5%；Ⅱ级：细胞大小略不均匀，形状略不规整，碎片10%～20%；Ⅲ级：细胞大小不均匀，形状不规整，碎片20%～50%；Ⅳ级：碎片＞50%。选择移植后剩余的Ⅰ～Ⅱ级胚胎冷冻保存。将胚胎依次置于磷酸缓冲液（PBS）、含1．5 mol/L丙二醇（PROH）的PBS、含1．5 mol/L PROH＋0．1 mol/L 蔗糖的PBS中平衡，然后将1～3个胚胎装入一个麦管，行程序化冷冻（Planer，kryo320－1．7，英国）。②子宫内膜的准备：有排卵的患者采用自然周期方案，月经第10天起B超监测卵泡发育和子宫内膜情况，若子宫内膜8～14 mm且为三线征，自然排卵后肌注黄体酮50～100 mg。激素替代方案用于无排卵的患者，月经第3天每日口服补佳乐2 mg（法国先灵制药，每片含戊酸雌二醇1 mg），每隔3d增加2 mg，至6 mg/d，此剂量维持至月经14d子宫内膜达到要求时肌注黄体酮，肌注黄体酮第三天定为移植日。③胚胎解冻：从液氮罐中取出冻存麦管，室温平衡30s，30℃水浴30s，剪断冻存麦管棉塞处，然后将胚胎依次转入含 1．0 mol/L PROH＋0．2 mol/L 蔗糖的PBS液、0．5 mol/L PROH＋0．2 mol/L 蔗糖的 PBS液、含0．2 mol/L蔗糖的PBS液和无PROH和蔗糖的PBS液中平衡，最后移入囊胚期G2培养液中，培养2h后进行移植。解冻后的胚胎评分标准同冷冻前，部分死亡的卵裂球记为碎片，50%上卵裂球存活的胚胎记为存活胚胎。④辅助孵出：移植前1h，LAH组采用1．48μm非接触式激光（MTG激光仪，德国）薄化透明带［5］。即将解冻后胚胎置于20倍倒置镜下，选择卵周隙相对较大或碎片集中区，调整激光靶心使其位于该区透明带外缘，根据透明带厚度通过改变照射时间来调整激光照射在透明带上的孔径，一般为20～25 ms，形成一个约相当于透明带总长度的1/4、深度为透明带总厚度的50%～80%的薄化区，将辅助孵出后的胚胎放入培养箱继续培养至移植。⑤胚胎移植与妊娠结局判断：选择1～3枚卵裂球存活不少于一半卵裂球的胚胎行B超下移植，移植后14d测尿h CG，阳性者移植后4周超声检查示子宫腔内见妊娠囊及原始心管搏动即确定为临床妊娠。

3 统计学处理 采用SPSS 10．0软件对数据进行处理，行方差分析和χ2检验。

结 果

临床结果见附表。患者在平均年龄、平均移植胚胎数上，两组无显著差异。在临床妊娠率上，LAH组为53．3% （30/56），对照组为36．7% （22/60），LAH组较对照组高，两组之间差异具有显著性 （P＜0．05）；在胚胎种植率上，LA H 组为29．3%，对照组为17．9%，两组之间差异具有显著性（P＜0．05）。

附表 LAH组与对照组临床数据比较

讨 论

胚胎冷冻技术可提高辅助生殖技术（ART）的周期效率，但临床妊娠率、种植率比新鲜周期低。目前的研究认为，透明带在暴露于极低的温度后变硬导致孵出困难是临床妊娠率、种植率下降的主要原因。辅助孵出是对移植前胚胎施行人工开口或削减其厚度，使胚胎更易孵出的方法，主要方法有机械切割法、激光法、酸化法等［6－7］。目前，不同辅助孵出方法的效果仍存在争议，Balaban等［8］对透明带切割法（PZD）、酸化法、酶化法和激光法研究比较，结果发现4种方法的妊娠率和胚胎种植率相似。罗亚宁等［9］的研究中认为，对前次IVF失败者和透明带较厚患者的透明带进行局部激光薄化，可取得很好的助孕结果。同样，张爱军等［10］的研究也表明激光法可以显著提高囊胚的孵出率。Kung等［11］则采用激光法对d3胚胎的透明带进行薄化后培养至囊胚，部分移植部分冷冻，也同样获得了理想的妊娠率和种植率。尽管LA H被认为是一种安全的途径，但因激光在AH过程中会产生热量，可能影响到胚胎发育潜能，同时对胚胎透明带的显微操作会增加发生单卵双胎的危险性［12］。美国生殖医学会（ASRM）［13］认为目前没有证据表明辅助孵出可作为常规技术应用于辅助生殖领域中，其安全性及有效性有待于进一步实验证实。ASRM建议辅助孵出应用于临床上预后差的患者，包括两次或以上IVF周期失败者，胚胎质量差者，高龄患者（＞38岁）。在我们的研究中，为了尽可能排除干扰因素，所选择两组患者均为前次FET周期移植胚胎质量好而未妊娠者，且平均年龄、不孕原因、FSH基础值、子宫内膜厚度、每周期移植胚胎数、复苏后无损伤胚胎存活率、移植胚胎形态学评分、透明带厚度等比较均无显著性差异。LAH组临床妊娠率，胚胎种植率明显高于对照组（P＜0．05），而早期流产率并未显著性差异，提示LA H处理后有利于胚胎的孵出，可提高胚胎的着床效率。对于FET周期反复失败患者行LAH可改善患者的预后。然而，在临床应用中，操作者的经验至关重要，激光薄化透明带的位置、厚度、作用时间，对于胚胎发育和着床是至关重要的。尽管LAH对提高反复FET周期失败患者的预后有所帮助，但激光的物理热效应对胚胎发育的远期影响有待观察，因此该项技术还不宜应用于所有FET周期。

［1］Ger mond M，Nocera D，Senn A，et al．Improved fertilization and i mplantation rates after non－touch zona pellucida micr odrilling of mouse oocytes with a 1．48 micro m diode laser beam［J］．Hu m Reprod，1996，11（5）：1043－1048．

［2］Vanderzw P，Bertin G，Debauche CH，et al．Vitrification of hu man blastocysts with t he He mi－Straw carrier；application of assisted hatching after thawing［J］．Hu man Reproduction，2003，18（7）：1504－1511．

［3］Balaban B，Ur man B，Yakin K，et al．Laser－assisted hatching increases pregnancy and i mplantation rates in cr yopreser ved embr yos that were allowed to cleave in vitr o after thawing：a prospective rando m zed study［J］．Hu man Repr oduction，2006，21（8）：2136－2140．

［4］邓晓惠．生殖医学技术及其彩色图谱［M］．济南：山东科学技术出版社，2004：20－21．

［5］Gab rielsen A，Ager hol m I，Toft B，et al．Assisted hatching i mproves i mplantation rates on cryopreserved－thawed e mbryos：a rando mized prospective study［J］．Hu m Repr od，2004，19（10）：2258－2262．

［6］Ng EHY，Chan CCW，Tang OS，et al．Comparison of endo metrial and sub endo metrial blood flow measured by three di mensional powers Doppler ultrasound bet ween sti mulated and natural cycles in the sa me patients［J］．Hu m Reprod，2004，19（10）：2385－2390．

［7］Gabrielsen A，Ager hol m I，Toft B，et al．Assisted hatching i mproves i mplantation rates on cryopreserved－thawed embryos．A randomized prospective study［J］．Hu m Repr od，2004，19（10）：2 258－262．

［8］Balaban B，Ur man B，Alatas C，et al．A comparison of four different techniques of assisted hatching ［J］．Hu m Reprod，2002，17（5）：1239－1243．

［9］罗亚宁，肖西峰，王晓红，等．激光薄化部分透明带辅助孵化的临床应用［J］．陕西医学杂志，2008，37（6）：663－665．

［10］张爱军，冯 云，夏 兰，等．不同机械辅助孵化方式对小鼠胚胎体外发育影响的研究［J］．生殖与避孕，2005，25（11）：675－678．

［11］Kung FT，Lin1 YC，Tseng YJ，et al．Transfer of frozent hawed blastocysts t hat under went quarter laser－assisted hatching at the day3 cleaving stage before freezing ［J］．Fertil Steril，2003，79（4）：893－899．

［12］Schieve LA，Meikle SF，Peterson HB，et al．Does assisted hatching pose a risk for monozygotic t winning in pregnancy conceived through in vitro fertilization［J］．Fertil Steril，2000，74：288－294．

［13］American Society for Reproductive Medicine．The role of assisted hatching in vitro fertilization：A review of literature：A co mmittee opinion ［J］．Fertil Steril，2008，90：196－198．