哮喘患者外周血转录因子Foxp3 mRNA表达水平及临床意义

西安市第一医院（西安710002） 谭 楠

支气管哮喘是由多种细胞和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，其发病机制尚不完全清楚，T淋巴细胞在哮喘发生、发展过程中发挥重要作用。CD4＋CD25＋Treg细胞是新近发现的具有特异细胞膜表面分子和核转录因子的一类T细胞亚群，叉头翼状螺旋转录因子3（Foxp3）是Treg细胞的发育和功能维持中发挥重要作用的转录因子［1］。国内外研究证实哮喘患者体内，CD4＋CD25＋Treg细胞数量较正常人减少［2－4］，但有关Foxp3在哮喘中作用研究较少。本研究通过检测不同分期及不同疾病严重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表达水平，初步探讨Foxp3在哮喘发病中的作用。

对象与方法

1 研究对象 选择2010年1～6月在我院住院的哮喘患者63例，男30例，女33例，平均年龄34．65±8．36岁。所有患者均符合2003年中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制订的支气管哮喘防治指南中的诊断标准，并根据标准分为急性发作期36例（其中轻中度23例，重度13例），非急性发作期27例。正常对照组40例，男19例，女21例，平均年龄32．79±8．15岁，为我院健康体检者，均无过敏病史及家族史，近期无感染及其它疾病。

2 方 法 采集研究对象肘静脉肝素抗凝血5 ml，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，提取细胞总RNA，应用Fer mentas逆转录试剂盒合成的c DNA。根据文献［5］合成Foxp3及内参照GAPDH引物，具体引物序列如下：Foxp3 上 游 引 物 5＇－CTACGCCACGCTCATCCGCTGG－3＇，下游引物5＇－GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG－3＇，内参照 GAPDH 上游引物5＇－GCACCGTCAAGGCTGAGAAC－3＇，下 游 引 物 5＇－TGGTGAAGACGCCAGTGGA－3＇。20μl PCR 反应体系如下：10μl SYBRRPre mix Ex TaqTMⅡ（2×）、2μmol/L上、下游引物各2μl、6．0μl c DNA。采用两步法进行PCR扩增，其程序如下：95℃预变性30s，95℃5s、60℃30s 40个循环。扩增结束后利用Bio－Rad IQ520 Standar d Edition Optical Syste m Soft ware V2．0进行数据分析。

3 统计学处理 利用SPSS 16．0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 哮喘组和对照组Foxp3 mRNA表达水平的比较 见表1。哮喘组患者外周血Foxp3 mRNA表达水平明显降低，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0．05）。

表1 哮喘组和对照组Foxp3 mRNA表达水平的比较

2 不同临床分期哮喘组Foxp3 mRNA表达水平的比较 见表2。急性发作期患者外周血Foxp3 mRNA表达水平明显降低，与非急性发作期患者相比差异有统计学意义（P＜0．05）。

表2 不同临床分期哮喘组Foxp3 mRNA表达水平的比较

3 急性发作期不同严重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表达水平的比较 见表3。急性发作期重度哮喘患者外周血Foxp3 mRNA表达水平明显降低，与轻中度患者相比差异有统计学意义（P＜0．05）。

表3 急性发作期不同严重程度哮喘患者Foxp3 mRNA表达水平的比较

讨 论

哮喘的发病机制不完全清楚，可能与免疫反应、神经反应及气道高反应性有关，研究证实免疫功能紊乱参与了哮喘的发病过程，辅助性T细胞（主要是Th2细胞）数量增加或功能异常与哮喘发病密切相关。1995年Sakaguchi等人首先报道了小鼠体内天然存在CD4＋CD25＋Treg细胞，随后在人外周血中也发现了该群细胞。越来越多实验证实CD4＋CD25＋Treg细胞在自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫耐受及抗感染免疫等方面发挥重要的作用［6－8］。

我们前期研究结果［2］显示在哮喘患者体内CD4＋CD25＋Treg细胞数量较正常人减少，在哮喘的疾病活动中起着重要作用，是导致哮喘患者细胞免疫失调的重要原因，这与国内外研究结果一致［2－4］。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg细胞的发育和功能维持中发挥重要作用，是该群细胞的一个特征性标志［1］，为了研究Foxp3在哮喘发病中的作用，我们利用荧光定量PCR检测不同分期及不同疾病严重程度哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表达水平，结果发现哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA明显低于正常对照组，这与CD4＋CD25＋Treg细胞数量减少一致。Foxp3在CD4＋CD25＋Treg细胞的发育及功能成熟过程中发挥重要作用，Foxp3在哮喘患者体内表达降低，可能使CD4＋CD25＋Treg细胞数量减少，抑制其功能的发挥，从而打破了CD4＋CD25＋Treg细胞与Th2细胞之间的平衡，使Th2细胞增殖和活化增强，导致哮喘的发生。目前Foxp3对Treg细胞功能基因表达的调控机制尚未完全清楚，Foxp3可能抑制Treg细胞活化过程中的多个关键基因及激活其他许多基因的表达来参与Treg细胞的发育及功能成熟过程。同时我们的实验还发现在急性发作期及重度患者体内Foxp3 mRNA表达水平均明显降低，提示Foxp3与哮喘的分期及病情严重程度密切相关，Foxp3不仅与哮喘的发生有关，而且在其病程进展过程中发挥重要作用。

总之，本实验发现哮喘患者外周血中Foxp3 mRNA表达水平明显降低且与疾病分期及病情严重程度密切相关，Foxp3表达水平降低可能在哮喘的发病过程中发挥作用，但具体的机制需要进一步研究证实。随着对CD4＋CD25＋Treg细胞及Foxp3的研究不断深入，有可能通过上调Foxp3的水平使CD4＋CD25＋Treg数量增加或功能增强，重建CD4＋CD25＋Treg细胞与Th2细胞之间的平衡，为哮喘治疗提供新的思路。

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