荷瘤鼠及口腔癌患者热化疗前后T淋巴细胞亚群、白细胞介素-2和肿瘤坏死因子-α水平的变化

史春生 金慧军 赵君 王升志 毛祖彝

（1.烟台市福山区人民医院 口腔科，烟台 265500；2.青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院 口腔颌面外科，烟台 264000；3.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学，成都 610041）

恶性肿瘤的发生、发展和治疗后的效果与机体的免疫功能状态有着非常密切的关系。在肿瘤治疗中，化疗最大的问题就是药物对免疫系统和造血系统的损伤。热化疗作为一种很有前途的癌症治疗手段[1]，可以降解化疗药物的毒副作用[2]。学者们认为其具有明显的生物学效应[3-4]。热化疗除了直接杀伤肿瘤细胞以及增强局部化疗药效外[3]，还可以刺激免疫系统的功能，增加CD3+T、CD4+T细胞的数量，提高CD4+/CD8+的比值[5-6]。另外，细胞因子在肿瘤发生、发展及肿瘤治疗方面的价值日益受到人们的重视，其中白细胞介素（interleukin，IL）-2和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α在细胞因子抗肿瘤方面的作用有着非常重要的地位[7-8]，但目前关于热化疗后口腔癌宿主T细胞和细胞因子功能状态的变化及其相互关系尚无系统研究报道。本研究旨在通过对荷瘤鼠及口腔癌患者进行不同处理，观察热化疗对荷瘤宿主T细胞功能及IL-2和TNF-α水平变化的影响，探讨T细胞和细胞因子功能状态的变化间有无相关性，并进一步探讨热化疗引起荷瘤宿主免疫功能改变的机理。

1 材料和方法

1.1 试剂和设备

平阳霉素（天津太河制药有限公司），IL-2、TNF检测试剂盒（Sigma公司，美国），501型超级恒温器（上海实验仪器厂），915型微波热疗机（成都锦江电机厂），酶联免疫检测仪（DG-3022型，江苏省华东电子管厂）。

1.2 小鼠肿瘤模型的建立和热化疗处理

选取四川省抗生素研究所提供的8周龄Balb/c纯系小白鼠100只，雌雄各半。小白鼠分笼饲养3 d后，随机平均分为5组，分别为正常对照组（N组）、不治疗组（NT组）、平阳霉素治疗组（P组）、高温治疗组（H组）、高温联合平阳霉素治疗组（HP组），每组20只，雌雄各半。后4组为实验组，于开始治疗前48 h，经同一人操作，在每只小鼠右后足底皮下注入S180细胞（0.1mL培养基中2×107个瘤细胞，腹水型，皮下接种后可生成实体型。由四川大学生物治疗国家重点实验室提供）。接种瘤细胞48 h后，给P组和HP组小鼠腹腔注射平阳霉素（0.1mL培养基含0.2mg）；HP组给药后立即用恒温水（42.0℃±0.2℃）加温右后足荷瘤部位，历时30min。H组接受与HP组相同的加温处理。7 d后各治疗组重复上一次治疗。于第2次治疗后15 d将动物全部处死，完整剥离肿瘤称重，在无菌条件下取其脾脏，采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法行淋巴细胞转化指数（lymphocyte transformation index，LTI）及IL-2、TNF-α水平检测。

1.3 临床病例

选取2007年9月—2009年11月就诊于四川大学华西口腔医院热疗中心的20例口腔癌患者为研究对象。其中男性12人，女性8人。年龄42～70岁，平均56岁。被纳入的20例患者均未经任何治疗，无严重并发症和重复癌。其中唇癌12例，颜面皮肤癌8例。病理组织学诊断均为鳞状细胞癌，其中低分化4例，中分化10例，高分化6例。临床分期为T2～T4。

1.4 患者的热化疗处理

对20例口腔癌患者给予每周2次（周二、五），5周10次一疗程的热化疗处理。静脉注射平阳霉素8mg后，立即给予42.5℃±0.2℃、40min微波热疗。分别于第一次治疗前和最后一次治疗后采集外周静脉血，用MTT法[5]测IL-2、TNF-α水平，并采用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法行淋巴细胞转化实验及CD4+、CD8+T细胞亚群检测。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行分析。对动物实验IL-2、TNF-α水平结果行组间两两比较LSD-t检验；对动物实验LTI的结果按完全随机设计的多样本均数间的两两比较作q检验；对口腔癌患者热化疗前后LTI、T淋巴细胞亚群及IL-2、TNF-α水平行组间配对t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠的抑瘤效果

经热化疗后，HP组小鼠的抑瘤率达到83%，H组和P组的抑瘤率分别为50%和57%，HP组抑瘤效果明显高于H组和P组（P＜0.01）。

2.2 各组小鼠IL-2、TNF-α活性

各组小鼠IL-2、TNF-α活性的MTT检测结果见图1。第2次治疗后15 d，HP组和N组、H组和P组、P组和NT组之间的IL-2值差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组之间的IL-2值差异均有统计学意义（P＜0.01），TNF-α与之相同。

2.3 各组小鼠的LTI

第2次治疗后15 d，各组小鼠LTI的MTT检测结果见图2。由图2可见，HP组、H组与N组小鼠的LTI差异无统计学意义（P＞0.05），而P组和NT组与HP组、H组、N组的LTI差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 20例口腔癌患者热化疗前后各检测值的变化

20例口腔癌患者热化疗前后IL-2、TNF-α的活性以及LTI、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的变化见图3。由图3可见，在热化疗后IL-2和TNF–α明显升高（P＜0.01）；采用3H-TdR掺入法行淋巴细胞转化实验及CD4+、CD8+T细胞亚群检测发现，在热化疗后LTI、CD4+及CD4+/CD8+明显升高（P＜0.01），而CD8+值无明显变化（P＞0.05）。

3 讨论

T淋巴细胞在肿瘤的免疫效应中起着非常重要的作用，它不仅能直接杀伤肿瘤细胞，而且能产生许多淋巴因子调节机体的免疫状态[9-11]。T细胞分为CD4+和CD8+两大亚群，按功能不同分为辅助性T细胞（help T cell，Th）、细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL或Tc）、抑制性T细胞（suppressor T cell，Ts）。CD4+T细胞主要是Th细胞，少数为CTL，其对抗体生成、巨噬细胞活化及CTL的活化有辅助、放大效应，并通过它们发挥作用。Ts能通过抑制细胞免疫功能来调节机体的免疫应答，正常状态下保持着一定的数量及活性水平，当发生肿瘤后，这类细胞数量显著增多，抑制机体对肿瘤的免疫效应，从而使肿瘤逃避机体的免疫监视，促进肿瘤的生长。

细胞因子在与靶细胞膜上特异性受体结合后发挥免疫功能作用。肿瘤可通过各种不同途径来影响机体的免疫功能，使荷瘤宿主呈现免疫抑制状态，其中一种是肿瘤细胞分泌的转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），它可以抑制IL-2诱导的T细胞和IL-2受体的表达，抑制T细胞活化，从而抑制IL-2的分泌；而肿瘤细胞分泌的前列腺素（prostaglandin，PG）也能使IL-2受到抑制。肿瘤使巨噬细胞和淋巴细胞受到抑制，从而使TNF-α分泌减少。

近几年国内外多项研究表明，癌症患者外周血T细胞亚群有着明显的变化，CD4+细胞（Th）减少，CD8+细胞（Ts和Tc）增多，CD4+/CD8+比值下降或倒置，且这种变化随着肿瘤的进展愈加明显[12-15]。其机理是肿瘤通过表达、释放某种肿瘤抗原或其他可溶性物质诱导激活Ts细胞，从而参与机体的免疫抑制[4]。而在本文动物实验中，NT组和P组由于免疫系统的抑制，淋巴细胞转化指数及产生的IL-2、TNF活性下降，与N组相比差异有统计学意义（P＜0.01）；HP组由于受到热疗和化疗的作用，LTI及IL-2、TNF-α活性均升高，与NT及P组差异均有统计学意义（P＜0.01），而与N组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。临床实验中，口腔癌患者IL-2、TNF-α水平以及LTI、CD4+和CD4+/CD8+在热化疗后明显升高（P＜0.01）。表明热化疗后可使荷瘤机体的免疫抑制状态得以解除，机体免疫功能增强，LTI及其产生细胞因子的能力均提高，从而机体对肿瘤细胞的细胞免疫应答增强。同时该结果也提示热化疗组不会因为化疗药物的副作用而降低温热对淋巴细胞功能的影响，也不会由于温热过度刺激免疫系统，导致免疫功能的紊乱。

IL-2在肿瘤免疫中作为最重要的细胞因子之一，具有以下功能：1）增强T细胞功能[16]，IL-2是T细胞最重要的生长因子，能直接或间接促T细胞的增殖活化，诱导CTL，维持T细胞增殖，增加细胞因子的产生，通过活化CTL或Th发挥抗癌作用；2）诱导和增强自然杀伤细胞、CTL的活性[17]；3）诱导T细胞分泌细胞因子；4）增强抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[18]。本实验荷瘤鼠以及口腔癌患者热化疗后，IL-2、LTI、CD4+及CD4+/CD8+明显升高，呈现相同变化趋势，从而进一步证明了IL-2能直接或间接促进T细胞的增殖活化，而活化的T细胞可以继续分泌细胞因子，协同增强免疫功能，二者之间存在着紧密的联系。

综上所述，热化疗后可使荷瘤宿主者免疫抑制状态得以解除，同时能降低化疗药物对机体免疫功能损伤的毒副作用，LTI升高，Th增多，IL-2、TNF-α等细胞因子活性增强，从而使机体免疫功能增强，机体对肿瘤的免疫应答加强。

[1]Colombo R,Salonia A,Leib Z,et al.Long-term outcomes of a randomized controlled trial comparing thermochemotherapy with mitomycin-C alone as adjuvant treatment for non-muscle-invasive bladder cancer（NMIBC）[J].BJU Int,2011,107（6）：912-918.

[2]Rowe RW,Strebel FR,Proett JM,et al.Fever-range whole body thermotherapy combined with oxaliplatin：A curative regimen in a pre-clinical breast cancer model[J].Int J Hyperthermia,2010,26（6）：565-576.

[3]Burd R,Dziedzic TS,Xu Y,et al.Tumor cell apoptosis,lymphocyte recruitment and tumor vascular changes are induced by low temperature,long duration（fever-like） whole body hyperthermia[J].J Cell Physiol,1998,177（1）：137-147.

[4]Zhao J,Wang SZ,Tang XF,et al.Analysis of thermochemotherapyinduced apoptosis and the protein expressions of Bcl-2 and Bax in maxillofacial squamous cell carcinomas[J].Med Oncol,2011,28（Suppl 1）：S354-S359.

[5]Storm FK.Hyperthermia in cancer therapy[M].Boston：GK Hall Medical Publishers,1983：487-544.

[6]梁新华,王升志,毛祖彝.热化疗对唇癌患者T淋巴细胞免疫功能的影响[J].四川大学学报：医学版,2004,35（2）：220-222.Liang Xinhua,Wang Shengzhi,Mao Zuyi.Effects of thermochemotherapy on immunologic function of patients with lip cancer[J].JSichuan University：Medical Science Edition,2004,35（2）：220-222.

[7]Westwood JA,Darcy PK,Guru PM,et al.Three agonist antibodies in combination with high-dose IL-2 eradicate orthotopic kidney cancer in mice[J].J Transl Med,2010,8：42.

[8]Nakagawa J,Saio M,Tamakawa N,et al.TNF expressed by tumor-associated macrophages,but notmicroglia,can eliminate glioma[J].Int J Oncol,2007,30（4）：803-811.

[9]Wang HY,Lee DA,Peng G,et al.Tumor-specific human CD4+regulatory T cells and their ligands：Implications for immunotherapy[J].Immunity,2004,20（1）：107-118.

[10]Qian F,Gnjatic S,Jäger E,et al.Th1/Th2 CD4+T cell responses against NY-ESO-1 in HLA-DPB1*0401/0402 patients with epithelial ovarian cancer[J].Cancer Immun,2004,4：12.

[11]Janssen EM,Droin NM,Lemmens EE,et al.CD4+T-cell help controls CD8+T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death[J].Nature,2005,434（7029）：88-93.

[12]Waziri A,Killory B,Ogden AT 3rd,et al.Preferential in situ CD4+CD56+T cell activation and expansion within human glioblastoma[J].J Immunol,2008,180（11）：7673-7680.

[13]Wieckowski EU,Visus C,Szajnik M,et al.Tumor-derived microvesicles promote regulatory T cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated CD8+T lymphocytes[J].J Immunol,2009,183（6）：3720-3730.

[14]Brivio F,Fumagalli L,Parolini D,et al.T-helper/T-regulator lymphocyte ratio as a new immunobiological index to quantify the anticancer immune status in cancer patients[J].In Vivo,2008,22（5）：647-650.

[15]Mazur MA,Davis CC,Szabolcs P.Ex vivo expansion and Th1/Tc1 maturation of umbilical cord blood T cells by CD3/CD28 costimulation[J].Biol Blood Marrow Transplant,2008,14（10）：1190-1196.

[16]Salcedo R,Hixon JA,Stauffer JK,et al.Immunologic and therapeutic synergy of IL-27 and IL-2：Enhancement of T cell sensitization,tumor-specific CTL reactivity and complete regression of disseminated neuroblastoma metastases in the liver and bone marrow[J].J Immunol,2009,182（7）：4328-4338.

[17]Li YG,Wang ZP,Tian JQ,et al.Dendritic cell transfected with secondary lymphoid-tissue chemokine and/or interleukin-2 geneenhanced cytotoxicity of T-lymphocyte in human bladder tumor cell S in vitro[J].Cancer Invest,2009,27（9）：909-917.

[18]Hara M,Nakanishi H,Tsujimura K,et al.Interleukin-2 potentiation of cetuximab antitumor activity for epidermal growth factor receptor-overexpressing gastric cancer xenografts through antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Cancer Sci,2008,99（7）：1471-1478.