外源性磷酸肌酸钠对缺血再灌注骨骼肌保护机制的实验研究

丁 明，李大鹏，王昕辉，刘明明

断肢再植、四肢大血管损伤、骨筋膜室综合征、血栓形成及应用止血带时间过长等，均会引起肢体缺血。 缺血-再灌注（ischemia-refusion，I-R）损伤的概念也早已被提出[1]。目前认为缺血再灌注损伤与能量代谢有重要关系[2]。外源性磷酸肌酸钠作为一种外源性的能量合剂，临床上已经用于心脏停搏液中的心肌保护、充血性心衰及未成熟心肌保护等方面[3-5]。但外源性磷酸肌酸钠对骨骼肌缺血再灌注损伤的影响尚未见报道。本实验制备家兔肢体缺血再灌注损伤模型，探讨外源性磷酸肌酸钠对肢体缺血再灌注骨骼肌的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型建立 健康成年家兔40只，体重2.5～3.5 kg，雌雄不限，由中国人民解放军第八十九医院动物中心提供。随机分为对照组、缺血再灌注组（IR）、低浓度磷酸肌酸钠组（LCP)和高浓度磷酸肌酸钠组（HCP），每组10只。

1.2 实验方法 参照Crinnion等方法建立家兔后肢缺血再灌注损伤动物模型[6]。3%戊巴比妥钠（25 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉。无菌手术显露左大腿股血管鞘并游离股动静脉，于腹股沟韧带处用微血管夹阻断股动静脉，在阻断处以下用橡皮带弹性环扎以阻断侧支循环。4 h后取下橡皮带及血管夹，恢复肢体血供。①对照组：只解剖出股动静脉，不阻断不环扎；②缺血组：缺血4 h，恢复血流灌注前耳缘静脉给予生理盐水1 ml，恢复血流再灌注4 h；③低浓度组：缺血4 h，恢复血流灌注前耳缘静脉给予外源性磷酸肌酸钠溶液 （北京利祥制药有限公司生产，0.5 mg/ml，生产批号 100602）0.5 g，再灌注 4 h；④高浓度组：缺血4 h，恢复血流灌注前耳缘静脉给予外源性磷酸肌酸钠1 g，再灌注4 h。

1.3 检测项目及方法 四组分别于缺血前、缺血再通后1 h、缺血再通后4 h，3个时相点自右侧颈内静脉采集血样，并取术侧胫前肌组织，行免疫组织化学并制备电镜标本。

1.3.1 生化指标检测 天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）的测定采用罗氏P800全自动生化分析仪。丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）测定采用硫代巴比妥钠法和黄嘌呤氧化酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照说明书操作。主要仪器有Spectrumlab 22PC（上海棱光技术有限公司）分光光度计。

1.3.2 Bax、Bcl-2蛋白免疫组化检测和图像分析采用Image-pro Plus6.0图像分析系统软件对胫前肌组织切片进行分析，相同亮度低倍镜（×100）下拍摄图片，每张切片随机选择5个视野，得出统计场积分光密度值（IOD）。

1.3.3 电镜观察 将取得的胫前肌标本切成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，经30 g/L戊二醛4℃前固定2 h，再经锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅铀双重染色，透射电镜观察并摄片。

1.4 统计学处理 所得数据以均数加减标准差（x±s）表示。应用SPSS13.0 for Windows统计软件包进行数据处理，多组样本均数之间比较进行方差齐性检验，组间两两比较进行单因素方差分析，方差齐采用LSD法，不齐则采用Dunnet’s T3法。

2 结 果

2.1 血清学检测结果 缺血组再灌注后1、4 h，IR组较对照组 AST、LDH、MDA 显著升高 （P<0.01），SOD的活力则显著下降（P<0.01）；HCP和LCP组较IR 组 AST、LDH、MDA 降低显著 （P<0.05），SOD 的活力则显著升高（P<0.01），且HCP组较LCP组变化明显（P<0.05）。 见表 1。

表 1 四组AST、LDH、SOD、MDA变量关系（n=10）

2.2 Bc1-2蛋白、Bax蛋白表达及Bc1-2/Bax比值变化 缺血再灌注1、4 h后，IR组Bcl-2/BAX比值较对照组显著降低（P<0.01）。见表2。

表 2 四组Bcl-2、BAX基因Bcl-2/BAX变量关系（n=10）

2.3 电镜检测结果 三组缺血前均显示正常横纹肌肌组织结构。见图1～3。

图 1 缺血再灌注后4 h IR组电镜图片

图 2 缺血再灌注后4 h LCP组电镜图片

图 3 缺血再灌注后4 h HCP组的电镜图片

3 讨 论

肢体缺血再灌注损伤指肢体缺血达到一定时间，在恢复血供后，反而出现比缺血时更加严重的损伤，表现为组织结构与功能损害的进一步加重。临床常见的缺血再灌注损伤有严重组织水肿、骨筋膜室综合征、肌纤维挛缩，严重者可导致肢体残疾。肢体缺血再灌注损伤的发病机制尚未完全明了，目前观点较多，如氧自由基损伤、钙超载、白细胞浸润和内皮的自稳态失衡等。其中氧自由基在肢体缺血再灌注损伤中的作用得到多数人肯定，是造成缺血再灌注损伤发病的重要环节[7，8]。

正常肌细胞内含丰富的AST、LDH，肌细胞受损后，酶可释放入血。因此，血清中该酶的含量可作为肌细胞损伤的指标，含量高低可反映细胞损伤的程度。测定SOD的活力可反映组织内自由基水平及脂质过氧化的程度[9]。丙二醛（MDA）是脂质过氧化作用的最终产物，它的含量反映了机体脂质过氧化的速度和强度，间接反映体内自由基的水平，其含量可间接反映肢体缺血再灌注损伤的程度。

Bcl-2基因具有促进细胞生存的作用，通过抑制钙离子释放[10]、抑制p53诱导细胞凋亡[11]、抑制自由基生成[12]、稳定线粒体膜[13]发挥作用。Bax基因与Bcl-2作用相反，属于促凋亡基因。最新研究表明，Bax蛋白发挥作用需要通过与Bcl-2蛋白形成二聚体。Bax高表达，形成Bax/Bax同源二聚体促进凋亡；Bcl-2高表达，则形成Bcl-2/Bax异源二聚体抑制凋亡。Bcl-2与Bax的比值是决定细胞凋亡作用强弱的关键[14]。

缺血再灌注损伤与线粒体结构和功能改变有重要关系。线粒体是细胞能量代谢中心，在维持细胞生理功能中发挥重要作用，尤其在缺血再灌注损伤发生及其发展中起中心环节作用[15]。外源性磷酸肌酸钠（CP）能维持线粒体膜结构的完整，使线粒体膜电位维持在较高水平，维持呼吸链正常氧化磷脂化功能，保证ATP的正常生成，维持细胞内高能量水平。CP可以抑制5’-核苷酸酶的活性，使溶血磷脂酸甘油脂浓度下降，稳定磷脂膜。CP维持ATP高水平，使氧自由基生产减少，保护机体免受氧自由基损伤。CP能使细胞较快恢复Ca2+顺利反流入肌浆网，避免细胞内游离钙离子浓度偏高。

本文实验结果显示，缺血再灌注后IR、HCP、LCP各组 AST、LDH、MDA均升高，SOD亦有下降（P<0.05），但 IR 组 AST、LDH、MDA 升高及 SOD 下降均较LCP组显著（P<0.05），较HCP组非常显著（P<0.01）。Bcl-2/BAX比值在HCP与LCP组升高，对细胞凋亡起到一定抑制作用。表明再灌注期间，氧自由基及其引发的脂质过氧化反应造成骨骼肌细胞的损伤，经电镜形态学观察证实在缺血再灌注4 h后细胞损伤明显。应用CP组细胞损伤较缺血组减轻，且高浓度组保护作用更为明显。说明应用外源性磷酸肌酸钠能显著保护缺血再灌注时肌细胞，减轻脂质过氧化反应，减少MDA的生成，维持SOD的活力，保护细胞膜的完整性，抑制AST、LDH的释放，减轻细胞内线粒体的损伤，对肢体缺血再灌注损伤有显著的保护作用。本研究为外源性磷酸肌酸钠在肢体缺血再灌注损伤保护方面，提供了一定的实验参考。

[1]Mccord JM.Oxygen-derived free radicals in past ischemic issue injury[J].N Engl J Med，1985，312(3):159-162.

[2]Illing B，Hom M，Han H，et al.Protective effect of the specific endothelin-1 antagonist BQ610 on mechanical function and energy metabolism during ischemia/reperfusion injury in isolated perfused rat hearts[J].J Cardiovasc Pharmacol，1996，27(4):487.

[3]袁 彪，朱朗标，王冬青，等.外源性磷酸肌酸在心脏直视术中心肌保护效果的观察[J].解放军医学杂志，2000，25(2)：112.

[4]吴 蔚，张湘兰，高 宁.磷酸肌酸治疗充血性心力衰竭的临床观察[J].心血管康复医学杂志，2000，9(4):52.

[5]金 峰，李 彤，杨景学，等.外源性磷酸肌酸对未成熟心肌的保护作用[J].第四军医大学学报，2000，21(5):523.

[6]Balestrino M，Lensman M.Role of creatine and phosphocreatine in neuronal protection from anoxic and ischemic damage[J].Amino Acids，2002，23(1-3):221.

[7]王卫国，邓展生，龚家林，等.缺血预处理对肢体缺血再灌注损伤的保护作用[J].湖南医科大学学报，2000，25(4):353.

[8]Maines MD，Panahian N.The heme oxygenase system and celluar defense mechanisms Do H0-1 and H0-2 have different functions[J].Adv Exp Med Biol，2001，502（3）:249-272.

[9]Janero DR.Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation tissue injury[J].Free Radic Biol Med，1990，9(6):515-540.

[10]Krajewski S，Tanaka S，Takayama S，et al.Investigation of the subcellular distribution of Bcl-2 oncoprotein[J].Cancer Res，1993，53(19):4701-4714.

[11]Li Y，Chopp M，Zhang ZG，et al.p53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke，1994，25(4):849-855.

[12]Jacobson MD.Reactive oxygen species and programmed cell death[J].Trends Biochem Sci，1996，21(3):83-86.

[13]Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of apoptosis by Bcl-2 release of cytochrome C from mitochondria block[J].Science，1997，275(5303):1129-1132.

[14]Yang E，Korsmeyer SJ.Molecullar thanatopsis:A discourse on the Bcl-2 family and cell death[J].Blood，1996，88(2):386-401.

[15]Hirata T，Fukuse T，Kawashima M，et al.High energy phosphates，mitochondria and reperfusion injury in isolated rat lungs[J].Transplant Proc，1998，30(7):3377.