茶多酚对哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的干预研究*

杨 青 王 尧 李里香 况九龙

支气管哮喘（哮喘）是我国常见病之一。临床上对于轻中度哮喘常规用激素治疗，疗效确切，但对于难治性、重症哮喘或皮质激素抵抗型哮喘，激素治疗效果不甚理想。对于哮喘气道重塑发病机制至今仍不十分清楚，其中氧化/抗氧化失衡学说是近年来讨论的热点，即认为哮喘是由于机体活性氧增多、脂质过氧化增强和（或）抗氧化能力降低，最终导致氧化/抗氧化失衡[1]。持续反复引起肺损伤，从而进一步加重哮喘发作。茶多酚（tea polyphenols，TP）是从茶叶中提取的一种纯天然抗氧化药物，主要成分是4个含有儿茶素的单体，通过提供大量羟基来清除氧自由基，具有强抗氧化、抗突变、抗癌变、抗菌、抗病毒等多种生物学功能[2]。本实验通过研究茶多酚对支气管哮喘大鼠早期及晚期气道炎症、气道重塑与氧化应激水平的干预及影响，并探讨哮喘气道重塑发生的可能机制，以指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原菌级别雌性SD大鼠48只，4～6周龄，体质量（160±10）g，购自南昌大学医学实验动物中心。在温度为（25±1）℃的饲养室中群居饲养，提供充足的食物和水源。所有动物在开始实验前至少饲养1周以适应环境。

1.2 主要试剂和仪器 HE病理染色试剂盒、Masson病理染色试剂盒、PAS病理染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司；转化生长因子（TGF）-β1成套免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司；大鼠TGF-β1 ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；茶多酚购自四川乐山禹伽茶业科技开发有限公司 （批号：TP-050801）。图像采集系统、采集软件（日本OLYMPUS公司）；ImagePro-plus 6.0真彩色医学图像分析软件（德国Leica公司）。

1.3 哮喘模型的制备 48只大鼠按随机数字表法分成对照组、哮喘组、早BUD组、早TP组、晚BUD组、晚TP组，每组8只。除对照组外，其他各组均进行哮喘模型的制备。参照Palmans等[3-4]的方法并稍做改进：在造模第1天、第8天各注射卵蛋白（OVA）混悬液1 mL；对照组用1 mL生理盐水代替。致敏2周（造模15 d）后雾化吸入OVA，每次雾化约30 min，隔日1次，对照组用生理盐水雾化。以大鼠出现烦躁、搔鼻、呼吸加快、口唇发绀、腹肌痉挛、点头呼吸及四肢瘫软等表现为激发成功。

1.4 给药方法 早BUD组：在造模前2周，开始雾化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。在造模时期，于雾化1%OVA前2 h时开始雾化布地奈德，方法同前。晚BUD组：在造模5周后，于雾化1%OVA前2 h开始雾化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。早TP组：在造模前2周，开始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。 在造模时期，于雾化1%OVA前2 h时开始茶多酚灌胃，方法同前。晚TP组：在造模5周后，于雾化1%OVA前2 h时开始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。各组均干预至造模后 12 周。哮喘组除造模时用的OVA外不用其他药物干预。对照组仅予等量生理盐水。

1.5 肺组织病理切片、染色、分析 右肺中叶用4%中性多聚甲醛固定，常规石蜡包埋和切片，片厚3 μm，分别行HE染色、Masson染色、PAS染色和免疫组化染色。采用Img-Pro 6.0图像分析系统，每张切片在400倍显微镜下，确定5个完整支气管横截面，分别测取其支气管基底膜内壁周径(Pbm)、平滑肌面积（WAm）、胶原沉积面积（Wcol），并用Pbm将测量值标化，分别以WAm/Pbm和Wcol/Pbm代表相应管壁层的厚度，每个支气管各测5次，取其均值。测定TGF-β1免疫组化染色切片的积分光密度（IOD）值，每张切片随机读取10个视野测定IOD值，取平均值。

1.6 肺组织TGF-β1含量测定及氧化应激水平测定 采用ABC-ELISA测定肺组织中TGF-β1含量。采用TBA法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。操作按试剂盒内说明书进行。

2 结果

2.1 大鼠肺组织病理改变 （1）HE染色显示，哮喘组与对照组相比，支气管壁、间隔及血管周围有大量炎性细胞浸润，管腔明显变窄。早BUD组上述变化较哮喘组改善，晚BUD组改善不明显。（2）PAS染色显示，与早TP组相比，哮喘组支气管上皮杯状细胞明显增加，气道内黏液分泌旺盛。（3）Masson染色显示，晚TP组支气管壁周围平滑肌细胞核呈深棕色、细胞浆呈红色，胶原纤维呈蓝色。晚BUD组平滑肌增生、肥大明显，气道上皮下胶原沉积明显增多。（4）TGF-β1免疫组化染色结果显示，哮喘组TGF-β1广泛表达，主要表达在气道黏膜上皮层，平滑肌、炎性细胞、细胞间质也有表达。晚TP组TGF-β1表达减少，见图1。

2.2 各组间WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1的比较 对照组、早BUD组、早TP组和晚TP组WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1均低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。早BUD组与早TP组、晚BUD组与哮喘组之间上述指标比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 各组肺组织TGF-β1、MDA含量及SOD活性的比较 对照组、早TP组、早BUD组和晚TP组的MDA含量和TGF-β1的含量均低于哮喘组，SOD活性高于哮喘组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。早BUD组与早TP组、晚BUD组与哮喘组的上述指标比较差异均无统计学意义 （P>0.05），见表2。

Figure 1 Pathological sections of airway wall in different groups图1 各组气道壁病理切片

2.4 相关性分析 肺组织MDA含量与SOD活性呈负相关 （r=-0.573，P<0.01）。 TGF-β1 含量与MDA 含量呈正相关（r=0.458，P<0.01）。

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各组大鼠肺组织病理切片比较±s）

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各组大鼠肺组织病理切片比较±s）

*P<0.05，**P<0.01

对照组（1）哮喘组（2）早 BUD 组（3）早 TP 组（4）晚 BUD 组（5）晚 TP 组（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 WAm/Pbm（μm）3.68±0.46 8.72±1.58 4.63±0.83 4.84±0.92 8.09±1.25 7.01±1.07 29.33**13.24**10.75**10.20**1.66 4.49*0.55 Wcol/Pbm（μm）4.20±1.75 17.98±6.67 5.01±1.00 5.07±1.03 16.46±3.32 12.82±2.33 28.32**11.75**10.98**11.00**1.30 4.40*0.03 TGF-β1（IOD 值）1.28±0.31 10.42±2.88 2.26±0.63 2.36±0.91 9.73±2.12 8.07±1.64 49.52**15.45**13.79**13.62**1.17 3.97*0.17组别 n

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各组大鼠肺组织中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比较±s）

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各组大鼠肺组织中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比较±s）

*P<0.05，**P<0.01

对照组（1）哮喘组（2）早 BUD 组（3）早 TP 组（4）晚 BUD 组（5）晚 TP 组（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 MDA（μmol/g）5.67±1.09 12.81±3.32 6.97±1.32 6.88±1.28 10.84±2.47 8.71±1.62 17.40**10.03**8.96**9.10**2.02 6.29*0.14 SOD（U/mg）129.65±7.16 94.39±5.37 123.27±8.77 124.00±7.68 110.68±6.30 114.64±6.56 25.72**14.13**11.58**11.87**2.53 8.12*0.29 TGF-β1（mg/L）48.21±9.38 128.32±16.24 56.46±9.87 58.42±10.34 118.12±13.42 103.21±12.87 65.77**18.48**16.58**16.13**2.35 5.79*0.45组别 n

3 讨论

支气管哮喘的基本特征为气道慢性炎症、气道高反应性和气道重塑[5]。氧化应激上调了Th2介导的炎症反应，增加了支气管高反应性，促使了气道重塑的形成[6]。SOD作为体内重要的抗氧化酶，其活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。MDA是脂质过氧化反应的产物，其水平高低间接反映了细胞受自由基攻击的严重程度。本研究结果显示，哮喘肺组织中MDA含量升高，SOD活力明显下降，经药物干预后，氧化应激水平下降，以早TP组、早BUD组明显，晚TP组次之，晚BUD组无明显改善。

目前哮喘治疗指南强调吸入激素控制哮喘气道炎症。吸入激素可以有效地减轻哮喘症状，减少哮喘发作的频率和减轻发作时的严重程度，降低病死率[7]。有研究表明激素能改善气道重塑[8-9]，然而激素减缓气道重塑的作用尚存在争议[10]。TGF-β1具有强烈的致纤维化作用，是哮喘气道重塑的主要调控因子，可引起成纤维细胞、肌成纤维细胞增生，细胞外基质（ECM）合成增加、降解减少，导致气道重塑。TGF-β1表达量增加与气道胶原沉积面积呈正相关。本研究中观察到早TP组、晚TP组、早BUD组干预后各项气道重塑指标（WAm/Pbm、Wcol/Pbm、TGF-β1）较哮喘组均有改善，以早TP组改善最明显。晚期BUD组干预效果差，与临床上观察到激素对已经形成气道重塑的哮喘患者疗效一致。此外，激素抵抗型哮喘患者对激素治疗反应差，易发展成气道重塑。因此，对激素抵抗型哮喘患者需早期识别，在早期使用可替代的非激素的抗炎药物以减缓气道重塑的发生。

研究表明，在小鼠慢性哮喘模型中，予氧化还原剂活性蛋白硫氧还蛋白-1（TRX1）干预可明显抑制气道重塑的发生，对已出现的气道重塑也有减缓作用[11]。茶多酚具有超强的抗氧化作用，能直接清除超氧阴离子、羟自由基，抑制亚硝酸的形成及诱导型一氧化氮合酶mRNA的合成与转录，降低一氧化氮的蛋白水平及酶的活性，调节氧化/抗氧化系统的平衡[12]，从而提高抗氧化酶SOD活力，对抗自由基对血管内皮的损伤，改善微循环，减少支气管黏膜的渗出，这些都是治疗慢性哮喘的气道重构所必需的。本研究也观察到即使在气道重塑建立后给予茶多酚干预，肺组织病理切片的胶原沉积等病理改变仍有改善作用。此外，与激素相比较，茶多酚不良反应小[13]，这也是其他许多治疗哮喘药物所不具备的。应用茶多酚治疗能有效地清除体内的氧自由基、降低DNA的氧化损伤，抑制肺组织气道重塑的进程，其机制可能是通过提高体内抗氧化酶SOD的活性，降低肺组织中MDA的水平，减少气道炎性细胞浸润，从而有效改善慢性哮喘氧化/抗氧化失衡。

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