黄芩种质资源的ISSR分析

2012-07-14张红瑞马彦秋高致明王文全

河南农业大学学报 2012年4期

张红瑞，马彦秋，高致明，王文全

(1．河南农业大学中药材工程技术研究中心，河南郑州450002;2．北京中医药大学中药学院，北京100102)

黄芩为唇形科黄芩属多年生草本植物，药用部位为干燥根，主含黄酮类化合物，具有清湿热、泻火、解毒、安胎等功效［1］．黄芩分布于黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、河南、甘肃、陕西、山西、山东等地［2］．多年来黄芩药源一直以野生为主，由于社会需求不断增加，野生资源破坏严重［3］．经过调查发现，不同种源野生黄芩茎色有绿、紫两种颜色，花有紫、白、粉色之分，在叶片大小、株高、分枝等形态学性状上有较大变异．黄芩分子生物学方面的研究较为薄弱，主要是利用随机扩增的DNA多态性分析(RAPD)［4，5］进行分子遗传多样性研究．由于RAPD重复性较差，近年来，简单重复序列间扩增(inter-simple sequence repeat，ISSR)标记技术已广泛应用于植物的遗传多样性和亲缘关系研究，所用的PCR引物长度在20个核苷酸左右，可以采用与常规PCR相同的反应条件，稳定性比RAPD好［6］．目前在药用植物遗传多样性研究中也日趋增多［7～15］．本试验采用ISSR分子标记技术对野生黄芩54个种源的遗传多样性和亲缘关系进行研究，为黄芩种质资源的可持续利用和保护及品种选育等提供参考．

1 材料与方法

1．1 试验材料

试验所用材料为野生黄芩54个种源硅胶快速干燥保存的幼嫩叶片，种源来源见表1．

表1 黄芩种源来源Table 1 The resources of Scutellaria baicalensis wild provenances

1．2 试验方法

1．2．1 DNA的提取采用十二烷基苯磺酸钠(SDS)法提取DNA，步骤如下:1)将硅胶干燥的黄芩叶片在液氮中研成粉末，置于1．5 mL离心管中，加入600 μL SDS缓冲液，65℃水浴30～60 min;2)取出，加入 5 mol·L－1KAC 200 μL，冰水浴 10 min;3)取出，加入 V(氯仿)∶V(异戊醇)为 24∶1，充分混匀，室温下静置 10 min，10 000 r·min－1离心12 min;4)取上清液，加入600 μL异丙醇，混匀并静置，10 000 r·min－1离心 3 min;5)倒掉上清液，加入体积分数为75%的乙醇浸泡，倒掉乙醇，将DNA干燥后加入200 μL双蒸水溶解;6)紫外分光光度计测量DNA质量浓度和相对纯度，并将DNA 稀释成 20 mg·L－1，备用．

1．2．2 ISSR引物筛选本研究选用加拿大British Columbia大学提供的1套 (共100条)ISSR引物试剂盒(上海生工合成)，通过挑选来自3个种源的3个黄芩样品，分别用100个引物进行PCR扩增．在所用的100个引物中，有34个引物能得到较好扩增，这34个引物是808，810，811，812，813，814，815，817，821，823，824，825，827，830，840，841，845，846，847，850，851，852，858，859，860，866，873，878，880，881，889，890，891 和899．最终选择了808等9条多态性较高的引物用于黄芩ISSR－PCR扩增 (表2)．

1．2．3 ISSR－PCR 扩增参照文献［16］，略有改动．PCR 反应体系为:dd H2O 14．1 μL;10 × PCR buffer 2．5 μL(含 Mg2+);dNTP(2．5 mmol·L－1)2．5 μL;ISSR 引物 (5 μmol·L－1)2．5 μL;Taq 酶(2．5 U)0．4 μL;模板 DNA(20 mg·L－1)3 μL;总反应体积为25 μL．

PCR扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃预变性1 min;52℃或54℃退火1 min;72℃延伸2 min;40个循环，最后再72℃延伸 7 min．整个 ISSR－PCR反应共6步，时间大约为3．2 h．

1．2．4 电泳与成像 PCR反应产物取出后进行1．6%的琼脂糖凝胶电泳;电泳条件为:电压，5 V·cm－1;时间，1．5 ～2 h．经 EB 染色后，在 Genesnap凝胶成像系统下照相．

1．2．5 数据统计与分析在琼脂糖凝胶上，每个材料的每一条电泳谱带看作为一个遗传位点，在同一个位点上如有强带者或重复出现的弱带者计为“1”，无带者或不重复出现的弱带者计为“0”，计算其总扩增条带和特异性扩增条带数量．利用SPSS 11．5软件的类间平均链锁法，计算供试材料的欧氏距离，进行聚类分析，构建其聚类图．

2 结果与分析

2．1 黄芩种源的ISSR－PCR扩增结果

用从100条引物中筛选出的扩增条带多、清晰和稳定性好的9条引物对黄芩54个种源进行PCR扩增，结果显示，9条ISSR引物的扩增位点为7～15个，共96个位点，扩增位点的相对分子质量为200～2 000 bp，其中多态性扩增位点为5～12个，共77个，多态性位点占71．43% ～90．91%，平均值为 80．21%(表2)．

表2 黄芩ISSR引物及扩增结果Table 2 List of primers and the experiment results

2．2 黄芩种源DNA遗传多样性分析

黄芩54个种源的ISSR总扩增条带为31～56条，其中多态性扩增条带占18～43条(平均29．20个位点)，多态性条带比率为58．06% ～76．79%，平均值为68．73%，说明黄芩种源间的遗传多态性水平差异较大，遗传变异比较丰富．S49(吉林松原种源)的多态性扩增条带最多(43条)，占76.79%;而S4(河北承德丰宁Ⅲ种源)的最少(18条)，仅占58．06%(表3)．

2．3 黄芩种源的聚类分析

以类间平均连锁法对全部供试材料进行聚类，通过计算遗传距离来构建其聚类分析图(图1)．结果显示，黄芩54个种源比较自然地分为3个分支，其中S49(吉林乾安种源)单独为1个分支;S41(陕西佳县种源)和S48(辽宁建昌种源)为1个分支;其余51个种源为1个分支．从图1可见，吉林乾安种源与其他种源之间的遗传距离相对较大，其亲缘关系相对较远;从51个种源形成的1个分支中可以看到，地域相近的种源首先聚在一起，如S14(河北承德Ⅲ种源)和S18(河北隆化Ⅰ种源)，S19(河北隆化Ⅱ种源)和S20(河北隆化Ⅲ种源)，也存在很多地域相差甚远的种源聚在一起的现象，如S47(辽宁朝阳种源)和S54(山东淄博种源)．

图1 黄芩54个种源ISSR聚类分析图Fig．1 Dendrogram of cluster analysis for fifty-four kinds of Scutellaria baicalensis

表3 不同种源黄芩遗传多样性分析结果Table 3 Genetic diversities in different population of Scutellaria baicalensis

3 结论与讨论

冯学锋等［4］对13个居群62个黄芩(Scutellaria baicalensis)和并头黄芩(Scutellaria scordifolia)样本进行RAPD分析，结果表明，黄芩遗传变异和地理环境有关系．邵爱娟等［5］对34个黄芩(包括栽培和野生)种源进行了RAPD分析，结果表明，黄芩种源间的遗传背景较为复杂，在遗传学上的分析结果与其外观形态大体相似，但与地理分布没有一定的相关性．ISSR具有多样性丰富、操作简单的特点，因此被广泛应用于生物多样性鉴定研究［17］．本研究采用ISSR分子标记对54个野生黄芩种源进行分析的结果表明，黄芩种源间的亲缘关系与其地理位置有一定的联系，地域相近的种源首先聚在一起，也存在地域相差甚远的种源聚在一起的现象．不同的标记方法得到的结论并不完全一致．这是由于不同的方法是从不同的水平和角度分析种质间的差异，所得到的结果就不可能是简单的重复或绝对的一致．在具体的研究中，应相互结合和印证，才能比较全面地解释研究结果．

近年来，由于国内外市场对黄芩药材和黄芩苷的需要量日益增加，野生黄芩资源破坏严重，在1987年颁布的《国家重点保护野生药材物种名录》里，黄芩被列为3级保护物种．本研究结果显示，野生黄芩种内具丰富的遗传变异，其多态性扩增位点80．21%．冯学锋等［4］的研究结果显示，黄芩居群间的遗传变异占总变异的18．83%，居群内变异占81．17%．邵爱娟等［5］的研究结果表明，不同种源黄芩(包括栽培和野生)间具有丰富的遗传多样性．说明导致野生黄芩资源不断减少并非是其遗传变异降低所致，人为过度采收和赖以生存的生态环境被破坏是中国野生黄芩资源急剧减少的主要因素．因此保护黄芩原产地生态环境和适度采收野生黄芩资源是恢复野生黄芩种群数量和蕴藏量最有效的途径．

黄芩在中国分布较广，特别是中国东部、西部气候差异较大，生态环境各异，造成了丰富多样的黄芩野生种群，为黄芩品种选育提供了很好的基因资源，有望从中培育出符合人们需要的优良品种．至于黄芩遗传基因与其形态变异的相关性还有待进一步研究．

［1］中华人民共和国国家药典委员会．中华人民共和国药典:1部［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:282－283．

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志:第65卷，第2分册［M］．北京:科学出版社，1977:136－249．

［3］杨全，白音，陈千良，等．黄芩资源现状及可持续利用的研究［J］．时珍国医国药，2006，17(7):1159 －1160．

［4］冯学锋，胡世林，郭宝林，等．黄芩种群遗传多样性初步研究［J］．世界科学技术—中药现代化，2002，4(4):38－43．

［5］邵爱娟，李欣，黄璐琦，等．不同种源黄芩的RAPD分析［J］．中国中药杂志，2006，31(6):452 －455．

［6］王建波．ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用［J］．遗传，2002，24(5):613 －616．

［7］周延清，景建洲，李振勇，等．怀区地黄遗传多样性的ISSR 鉴定［J］．中草药，2005，36(2):257 －261．

［8］罗群，马丹炜，王跃华．川乌遗传多样性的ISSR鉴定［J］．中草药，2006，37(10):1554 －1557．

［9］何俊，杨柏云，陈少风，等．多叶重楼遗传多样性的ISSR分析［J］．云南植物研究，2007，29(4):388－392．

［10］李靖，程舟，杨晓伶，等．人参农家类型遗传多样性的ISSR 分析［J］．中草药，2007，38(9):1392－1395．

［11］孙群，佟汉文，吴波，等．不同种源乌拉尔甘草形态和ISSR遗传多样性研究［J］．植物遗传资源学报，2007，8(1):56 －63．