黑豆多酚氧化酶的分离纯化及其酶学特性研究

2012-07-12安徽农业大学生命科学学院张宽朝全明吉

中国饲料 2012年19期

安徽农业大学生命科学学院张宽朝全明吉

黑豆，为豆科植物的种子，亦称乌豆、黑大豆。现代药理研究证实，黑豆含有丰富的蛋白质、卵磷脂、脂肪、维生素以及黑色素、烟酸等，具有抗氧化、增强免疫力、抗炎、抗癌、防止脂质过氧化等重要功能（王敏等，2008；陈颖和徐巍，2008）。多酚氧化酶（PPO）是自然界分布较为广泛的一种氧化还原酶，是一类含铜元素的金属蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。本试验以黑豆为试验材料，对其中的多酚氧化酶进行了分离纯化及酶学特性研究，以期为进一步研究多酚氧化酶的基本特性和调控黑豆的加工过程提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料黑豆：庐州黑豆，市售，经剥皮后用粉碎机破碎，备用。DE-52为Whatman分装；透析袋为Usa分装；PEG-20000为Ameresco分装；硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯二酚、PVP、EDTA、Tris、氢氧化钠、氯化钠、考马斯亮蓝G-250等均为国产分析纯。SP-722E分光光度计（上海光谱仪器有限公司），TGL-20M台式高速冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司），MC99-3自动液相色谱分离层析仪（上海沪西分析仪器厂有限公司），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 黑豆多酚氧化酶酶活性测定取2支试管，一支作为空白管加入3 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液，另一支加2 mL 1/15 mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲液，1 mL 0.1%邻苯二酚，摇匀。2支试管同时于50℃恒温预热5 min，分别加入0.5 mL酶液，立即计时，摇匀。准确恒温反应15 min，迅速取出于420 nm处比色读取 OD值（张雅芬等，2005）。PPO活力单位定义为：每分钟OD值变化0.001为一个酶的活力单位（U）。

1.2.2 黑豆多酚氧化酶的分离纯化

1.2.2.1 粗酶液的提取称取粉碎后黑豆粉，按照1∶2质量比例分别加入经过预冷（4℃）的 1/15 mol/L、pH为5.8、6.8和7.6的磷酸缓冲液（内含5%的PVP），于4℃下浸提2 h，用4层脱脂纱布过滤，滤液于4℃下10000 r/min，离心15 min，上清液即为多酚氧化酶粗酶液。

1.2.2.2 硫酸铵分级沉淀边搅拌边向粗酶液中加入固体硫酸铵粉末至饱和度为30%，4℃、10000 r/min离心10 min，弃去沉淀，继续向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80%，4℃、静置过夜，4℃、10000 r/min离心 15 min，倾倒上清液，留沉淀备用。

1.2.2.3 透析脱盐上述沉淀复溶于10 mL 1/150 mol/L、pH为 6.8的磷酸缓冲液，将复溶后的酶液装入已处理好的透析袋中，4℃以蒸馏水透析6 h后，于1/150 mol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液脱盐透析过夜。

1.2.2.4 DE-52层析纯化 DE-52依照常规处理，装层析柱，1/150 mol/L、pH 6.8磷酸缓冲液平衡过夜，将经饱和硫酸铵分级沉淀并已透析脱盐的酶液上样，以0至1 mol/L NaCl，pH 6.8磷酸缓冲液梯度洗脱，自动部分收集器收集洗脱液，每管5 min。合并收集相邻酶活性峰，PEG20000浓缩备用。

1.2.3 酶学特性研究

1.2.3.1 反应进程曲线的制作按1.2.1酶活测定体系加入pH 6.8的磷酸盐缓冲液、0.1%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，分别于 50 ℃恒温准确反应 5、10、20、25、30、40 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.3.2 最适pH 按1.2.1酶活测定体系，分别加入 pH 5.6、6.2、6.8、7.4、8.0 的磷酸盐缓冲液，0.1%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，分别于50℃恒温准确反应15 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.3.3 最适温度按1.2.1酶活测定体系，分别加入pH 6.8的磷酸盐缓冲液、0.1%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，分别于20、30、40、50、60 ℃恒温准确反应 15 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.3.4 最适底物浓度按1.2.1酶活测定体系，加入pH 6.8的磷酸盐缓冲液，再分别加入0.01%、0.02%、0.04%、0.05%、0.1%、0.2%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，于50℃恒温准确反应15 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.3.5 金属离子对黑豆多酚氧化酶活性的影响按1.2.1酶活测定体系，分别加入1.0、1.5、3.0 mg/mL MgSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaCl、CaCl2，pH 6.8 的磷酸盐缓冲液，0.1%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，于50℃恒温准确反应15 min，迅速取出测定酶活性。

1.2.3.6 抑制剂对黑豆多酚氧化酶活性的影响按1.2.1酶活测定体系，分别加入1.0、1.5、3.0mg/mL含抗坏血酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、Na2SO3， pH 6.8的磷酸盐缓冲液，0.1%邻苯二酚，摇匀，于50℃恒温预热5 min，加入酶液，于50℃恒温准确反应15 min，迅速取出测定酶活性。

1.3 数据处理试验数据采用Excel 2003进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 不同pH抽提法对黑豆PPO活性的影响由图1可知，在提取温度，浸提时间和PVP含量相同的情况下，pH对酶活的影响较大。分析抽提酶液，酶活性依次为 pH 6.8＞pH 5.8＞pH 7.6，pH 6.8时PPO活性最大，因此，后续试验过程中选取pH 6.8磷酸缓冲液作为黑豆多酚氧化酶的提取溶液。

2.2 黑豆多酚氧化酶的DE-52层析取黑豆粉末，经30%～80%饱和硫酸铵分级沉淀，1/150mol/L、pH 6.8的磷酸缓冲液透析脱盐过夜，上DE-52阴离子交换层析柱，以0至1mol/L NaCl，pH 6.8磷酸缓冲液（200 mL+200 mL）进行梯度洗脱，结果见图2。从图2可知，30%～80%硫酸铵分级沉淀初步纯化的黑豆PPO，经离子交换层析分离，仅有1个活性峰。

2.3 PPO的反应进程曲线从图3可知，在30 min以内，PPO催化反应的酶活力与反应时间基本成线性关系。在反应30 min后，PPO反应进程曲线逐渐变平。这是因为随着催化反应的进行，底物邻苯二酚在逐渐减少，而产物的生成量逐渐增多，对PPO酶的反馈抑制作用逐步加强，从而酶促活力增加速度下降。

2.4 黑豆多酚氧化酶的最适pH pH对PPO的影响一般是通过改变酶的构象实现的。pH不但影响酶活性基团的解离，也会影响底物的解离。由于PPO是含铜酶，pH较高或者较低都会导致Cu2+的解离及蛋白质的变性，从而使PPO失去活性。有研究报道，不同植物的PPO或同一植物基因家族中不同PPO基因的表达产物，其最适pH可能有所不同。莲藕中的PPO以邻苯二酚为底物，最适pH为7.0（黄建韶和田宏现，2002）。而烟草中的PPOI以邻苯二酚为底物，最适pH为7，PPOII的最适pH为6（戴亚等，2001）。由图4可知，当pH为5.5～6.8时，随着pH的逐渐增加，黑豆PPO的活性逐渐增强，当pH达到6.8时，PPO酶活性达到最高峰，然后，随着pH的继续增加，酶的活性逐渐减弱。因此，可知黑豆PPO的最适pH为6.8，在近中性范围内。

2.5 黑豆多酚氧化酶的最适温度从图5可知，在20～50℃，酶活性随着温度的升高而逐渐上升，50℃时酶活性最高。随着温度的进一步升高，酶活性呈不断下降的趋势。这是因为温度对酶反应的影响可归纳为两个方面，一是酶作为一种生物催化剂，随着温度的升高，活化分子数增多，催化效率增加，酶促反应速度加快；另一影响在于酶促反应具有其生物学性质，反应温度升高到一定程度，随着酶蛋白的变性程度加深，酶会逐步丧失其催化活力。因此，在20～50℃，可能是第一种效应起主导作用，适度提高温度，利于对酶朝着有利于底物发生作用的催化构象转变，而此后继续升高温度则会破坏酶的活性构象，酶活性不断下降。因此，黑豆PPO的最适反应温度是50℃，与番石榴最适反应温度是50℃结果相一致（杨昌鹏等，2006）。

2.6 底物浓度对酶活力的影响从图6可知，随着底物浓度增大，PPO酶活力逐渐增高，但当底物浓度到达一定值时（0.1%），随着底物浓度的增加，PPO酶活力增高幅度降低。其原因在于当底物浓度较低时，酶蛋白处于过量状态，而随着底物浓度逐渐增加，越来越多的底物与酶分子结合，此时，酶将逐渐饱和，直到达到最大饱和值。因此，以邻苯二酚做反应底物时，黑豆PPO最适反应底物浓度为0.1%。

2.7 金属离子对黑豆多酚氧化酶活性的影响以磷酸盐缓冲液内含金属离子作为反应体系，测定不同金属离子对黑豆PPO活性的影响，结果见图7和图8。因Cu2+作为PPO酶的辅因子，参与酶的组成，易在分离提纯过程中丢失，所以，在供试浓度范围内，低浓度外源Cu2+的加入，能够激活黑豆PPO酶活性。从图7可知，可提高酶活性至225%，而高浓度Cu2+则抑制PPO酶活性。由图8可知，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+、Ca2+对酶活性均有抑制作用，在供试浓度范围内，Mg2+、Zn2+、Fe2+、Na+对PPO活性的抑制均达到50%以上，而Ca2+对酶活性的抑制为50%左右。

2.8 抑制剂对黑豆多酚氧化酶活性的影响从图9可知，在供试浓度范围内，抗坏血酸、EDTA、Na2SO3均对黑豆PPO活性具抑制作用。抗坏血酸对PPO活性的抑制作用其机理可能在于维生素C作为PPO辅基铜离子的螯合剂与铜离子发生键联，导致PPO失活；或者是因为维生素C作为醌类物质的还原剂，将PPO酶促褐变反应的中间产物邻二醌还原成邻二酸，阻止了醌类物质进一步自发聚合形成褐色物质因而抑制了褐变，但是，抗坏血酸本身容易发生非酶褐变。EDTA属于金属离子螯合剂，对PPO活性抑制作用的机制是因为EDTA具有较强的Cu2+螯合能力，能够很大程度上螯合PPO中的Cu2+，因此形成稳定的螯合物而抑制了PPO的活性。Na2SO3对多酚氧化酶反应体系的抑制作用可能基于两个方面，一方面Na2SO3能不可逆地与醌加成，而生成无色的产物，从而抑制了PPO的褐变，另一方面，Na2SO3可能还有漂白和抑制微生物的作用（程建军等，2002）。在生产实践中，抗坏血酸为生物有机体本身所固有的营养成分，其安全性较高，所以可以作为理想的工业用抑制剂，而对于亚硫酸钠而言，则要充分考虑其在生物制品中的残留问题（杨昌鹏等，2006；程建军等，2002）。