宁夏部分地区鸡大肠埃希菌的分离与血清型鉴定

张燕飞，王 东＊，王玉炯，何玉龙，王建波，蒲建明，丁林军，扈登强

（1.宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021；2.银川市农业局，宁夏 银川 750001；3.吴忠市畜牧局，宁夏 吴忠 751100；4.宁夏博奥药业有限公司，宁夏 银川 750021）

禽大肠杆菌病是指由致病性大肠埃希菌引起各种禽类的急性或慢性的细菌性传染病。随着养禽业的发展，在病毒性疾病使用有效疫苗加以控制后，禽大肠杆菌病已上升为主要的传染病之一[1]，给养禽业造成严重经济损失。禽大肠埃希菌的血清型众多，国外已报道的血清型有160多种，最常见的致病血清型为 O1、O2、O78和 O35[2－4]；国内已报道的血清型多达50余种以上，不同地区差别较大[5－8]。为调查宁夏地区鸡大肠杆菌病的流行情况，给疾病防治工作提供理论依据，我们开展鸡大肠埃希菌的分离和鉴定等工作，并对其血清型进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料来源于宁夏银川市、石嘴山市、吴忠市和中卫市4个市14个县（区）的103个规模化鸡场发生疑似鸡大肠杆菌病的病鸡和死鸡。根据其症状和病变，分别以无菌方法采集心血、肝、脾、卵泡、输卵管等材料，供作细菌分离样品。

1.1.2 实验动物 实验动物为清洁级昆明小鼠，体重18g～20g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.1.3 培养基及试剂 营养肉汤、营养琼脂、麦康凯、伊红美蓝和三糖铁培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。大肠埃希菌生化试验微量发酵管购自杭州天和微生物试剂有限公司。大肠埃希菌“O”抗原定型诊断血清购自中国兽医药品监察所。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离培养 将病料接种到营养肉汤培养基中，37℃培养18h～24h；将有细菌生长的培养物分别接种营养琼脂、麦康凯、伊红美蓝和三糖铁培养基，37℃培养18h～24h；挑取典型菌落涂片，进行革兰染色和镜检，观察分离菌形态特征。

1.2.2 生化试验 根据分离菌的培养特性、染色特点和形态特征，将初步筛选符合大肠埃希菌的培养物分别接种于各种生化反应管中，进行生化特性鉴定[9]。

1.2.3 致病性试验 每株分离菌做活菌计数后，注射6只小鼠，0.2mL／只（含细菌数目2.0亿）；对照组6只，注射无菌生理盐水，0.2mL／只。攻毒后隔离饲养7d，观察发病和死亡情况。发病死亡小鼠取肝、脾做细菌分离鉴定[10－11]。

1.2.4 血清型鉴定 将有致病性的鸡大肠埃希菌分离菌株分别接种普通琼脂培养基，37℃培养24h，用5g／L石炭酸生理盐水洗下菌落，制成浓稠菌悬液。121℃高压2h后，用大肠埃希菌O抗原定型血清，采用玻板凝集试验和试管凝集试验，对所有分离菌株进行血清型鉴定[12－13]。

2 结果

2.1 细菌培养特性观察

分离菌在肉汤培养基中37℃培养18h～24h后，培养基呈均匀浑浊；在营养琼脂培养基上呈圆形、边缘整齐、隆起、光滑、湿润、灰白色菌落；在麦康凯培养基上呈砖红色菌落；在伊红美蓝培养基上呈黑色、带金属光泽的菌落；在三糖铁培养基上斜面和穿刺线均呈黄色。培养物经革兰染色镜检，可见两端纯圆、散在或成对的红色革兰阴性小杆菌。

2.2 生化试验结果

分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇；对乳糖和蔗糖，不同菌株间存在差异；MR试验阳性；VP试验阴性；枸橼酸盐阴性；硫化氢阴性；尿素酶阴性、靛基质阳性。

2.3 细菌分离

根据细菌培养特性和生化试验结果，从宁夏部分地区规模化鸡场采集疑似病料151份，分离和鉴定鸡大肠埃希菌109株，平均分离率为72.19%（109／151）。

2.4 致病性试验

将654只小鼠分为109组，每组6只，分别注射鸡大肠埃希菌，隔离观察7d，其中59株分离菌对小鼠有不同程度的致病性（死亡率33%～100%），占分离菌株的54.13%（59／109）。剖检死亡小鼠，可见肝肿大、呈暗红色；脾脏肿大；肺脏出血等病理变化。将死亡小鼠的肝、脾等脏器接种细菌培养基，均分离出大肠埃希菌。

2.5 血清型鉴定

从59株鸡致病性大肠埃希菌中确定血清型种类13种38株，占致病性菌株64.41%（38／59）；优势血清型为 O15、O18、O78、O88，占定型菌株63.16%（24／38）。宁夏鸡致病性大肠埃希菌血清型鉴定情况见表1。

3 讨论

从宁夏4个地区14个县（区）的103个规模化鸡场采集疑似病料151份，通过分离培养和生化试验，鉴定鸡大肠埃希菌109株，平均分离率为72.19%（109／151）；致病性试验表明，59株分离菌有致病性，占分离菌54.13%（59／109），说明鸡大肠杆菌病在宁夏各地区鸡场普遍存在，危害严重。

对59株鸡致病性大肠埃希菌进行血清型鉴定，除21株未能定型外，其他38株分别属于13个血清型，包括 O15、O18、O78、O88、O2、O20、O26、O35、O11、O27、O107、O111、O139，占致病性菌株64.41%（38／59）；O15、O18、O78、O88血清型出现频率较高，占定型菌株63.16%（24／38），说明它们是宁夏地区优势血清型菌株。抗生素的使用和菌苗预防接种是控制大肠杆菌病的主要手段。由于人们长期、大量使用抗生素等药物，药物防治面临耐药性和药物残留困扰，使用疫苗预防禽大肠杆菌病被越来越多的养殖户所采纳。鸡大肠埃希菌血清型较多，不同血清型的分离株间往往缺乏交叉保护，筛选本地优势血清型大肠埃希菌分离株制作灭活苗，更具针对性，实际应用效果更好。因此，分离菌株的血清型鉴定工作为宁夏地区鸡大肠杆菌病的防治工作提供了理论依据。

表1 宁夏鸡致病性大肠埃希菌血清型鉴定Table1 The serotype identification of Pathogenic E.coli of Chickens in Ningxia

禽大肠杆菌病是由病原性大肠埃希菌引起家禽的常见细菌性传染病，其血清型复杂多样，国外已报道的血清型有160多种，最常见的致病血清型为O1、O2、O78和 O35[2－4]。国内报道的血清型种类较多，云南以 O78、O11、O88为优势血清型[5]；河北南部以 O78、O65、O1、O93、O141为优势血清型[6]；湖南岳阳地区优势血清型为O78、O1、O2、O55[7]；江苏扬州地区优势血清型为 O78、O2、O127、O18、O1[8]；辽宁锦州地区优势血清型为O15，O35[14]；天津地区以 O78、O88、O2、O45、O53、O145为优势血清型[15]等。本次试验结果表明，宁夏地区鸡大肠埃希菌的优势血清型为O15、O18、O78、O88，与国内其它省份报道不完全相同，说明不同地区鸡场存在不同血清型。另外，本次调查还发现，同一地区不同鸡场，甚至同一鸡场、同一鸡群存在不同血清型菌株，与文献报道相似[5，16]。

在本次试验中，未定血清型的菌株有21株，占待鉴定菌株的35.59%（21／59），其中有15株不与试验用的任何“O”多价血清发生凝聚反应，有6株为抗原自凝，与文献报道[5]相似，其原因有待进一步研究。另外，本次试验还发现，有1株分离菌能同时与O18、O26因子血清发生明显凝集反应，这与文献报道[6]相似。

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