脑心肌炎病毒检测方法研究进展

张海霞，于国伟，冯玉萍

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030；2.西北民族大学西部环境健康研究所，甘肃兰州730030；3.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030）

猪脑心肌炎（Encephalomyocarditis，EMC）是由脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的一种自然疫源性人兽共患传染病。EMCV主要引起脑炎、心肌炎或心肌周围炎以及母猪的繁殖障碍。EMCV最早于1945年从美国佛罗里达州一只患急性心肌炎死亡的黑猩猩体内分离得到，并于1960年在巴拿马确诊为猪的致死性疾病病原体［1］。随后该病在多个国家暴发和流行［2］。我国于2005年首次从病死仔猪和流产胎儿中分离到EMCV［3］，血清学调查表明我国规模化猪场已普遍感染EMCV［4］。EMCV 可感染的宿主动物较多，例如猪、松鼠、大象、长颈鹿甚至蚊子等，其中猪是感染最普遍、最严重的动物，而鼠类是EMCV的自然储存宿主［5］。由于脑心肌炎会造成大量仔猪死亡、母猪产弱胎、死胎等，因此该病的发生与流行已严重影响了我国养猪业的发展。

1 EMCV病原学

EMCV属于微RNA病毒科心病毒属成员，为单股正链RNA病毒，其基因组全长约7.8 kb，结构为典型的5＇－UTR－（L）－4－3－4－3＇－UTR，即5＇非翻译区（5＇－UTR）和3＇非翻译区（3＇－UTR）中间连接1个引导蛋白（L蛋白）、4个结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和7个非结构蛋白（2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。VP1、VP2、VP3位于病毒粒子表面，VP4位于衣壳内侧并紧贴于VP1－VP2－VP3复合体，VP1－VP2－VP3－VP4复合体组成壳粒，壳粒以5－对称轴首先形成五聚体，再由12个五聚体形成15，3，2构型的20面体。其中VP1抗原性最强，为研究最多的结构蛋白［6］，而3D基因则是最保守基因，遗传精确性最高，常被用作病毒RNA检测的目标基因［7］。

2 EMCV检测方法

最早建立的检测EMCV较为经典可靠的方法是病毒的分离鉴定，但是该方法需要进行相应敏感细胞的病毒接种，待病变之后进行鉴定，因此较为耗时费力，不适用于快速诊断［8］；之后由Vlemmas J等建立的免疫组织化学法虽然可检测心脏、脾、胰腺等组织中的病原体，但是该法制备病理组织样品比较麻烦、耗时；后来由Meng X J等建立的放射性探针原位杂交技术，既具放射污染性，又操作冗长。鉴于这些方法各自存在的缺陷，建立一种更为高效、省时、简便的EMCV检测方法迫在眉睫。EMCV RTPCR检测方法的问世，为这一问题的解决提供了较好的途径，该法具有简便、快速、灵敏等特点［9］，成为实验室检测EMCV最常用的方法。随着对EMCV研究的深入，已经建立了多种新的检测方法，为猪脑心肌炎病的防控提供了科学依据。

2.1 EMCV血清学检测

对于血清学检测EMCV抗体常用的方法主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、血凝抑制试验（HI）、免疫荧光抗体试验（IFA）、琼脂糖免疫扩散试验（AGID）和病毒中和试验（VN），其中 VN 和ELISA最常用。VN是常用的特异性检测方法，但操作过程繁琐，费时费力。建立的ELISA方法多是基于EMCV结构蛋白［10－11］，虽可大规模地检测血清样品，省时省力，但是该方法需要制备特异性抗原，且常常无法区分免疫与野毒感染产生的抗体；基于非结构蛋白建立的ELISA方法则不仅适用于临床诊断和流行病学调查，且有望可以区分疫苗免疫和野毒感染。

由于2C蛋白为EMCV的非结构蛋白，参与病毒的复制，因此在病毒复制时才会产生该蛋白，并刺激机体产生抗体，鉴于此刘兰亚等［12］通过重组2C蛋白为包被抗原，建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法，经验证该方法能特异性的检出EMCV感染猪的血清2C抗体，与猪瘟病毒（CFSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV－2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等的抗血清没有交叉反应，且与血清中和试验符合率较高，为临床脑心肌炎的早期诊断和流行病学研究提供了技术手段。

2.2 EMCV病原学检测

通常用于EMCV病原学检测的方法主要有病毒中和试验（VN）、免疫组化试验（IHC）、核酸原位杂交技术（ISH）、反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）等，其中最常用的便是 VN 和 RT－PCR［13］。但是VN、IHC及ISH的过程均较为费时、费力，EMCV RT－PCR的建立很好的解决了这个问题［14］。但是由于常规RT－PCR分反转录和cDNA扩增两个步骤进行，因此操作繁琐，且加大了污染机率。一步法RT－PCR则是在RT－PCR基础上进一步的改进，该方法是在一个反应体系中，同时进行反转录及PCR反应，从样品RNA提取、反转录、PCR扩增到电泳观察的全部过程可在4 h内完成，可精确、快捷地扩增出目的片段，既可节省时间，又减少操作步骤，适合大规模推广应用。施开创等［15］根据EMCV的保守基因3D基因序列，设计合成相应引物，建立了检测EMCV的一步法RT－PCR，根据试验结果，该方法可扩增相应特异目的条带，而对FMDV、CFSV、PRRSV等检测结果均为阴性，证明该方法只对EMCV特异，经进一步试验可知其敏感性可达到2TCID50，说明建立的方法特异性强、灵敏度高，且通过临床样品检测，证实了该方法的可靠性，可用于EMCV的临床检测及流行病学调查。

2.3 其他一些新型检测EMCV方法的建立

由于上述建立的EMCV检测方法各有其缺陷性，因此更为灵敏、快速的新型EMCV检测方法相继问世，如建立的实时荧光定量PCR（real－time PCR），该方法以敏感、特异、污染少、可定量等优点著称，克服了RT－PCR只能定性不能定量，容易污染而产生假阳性，需电泳观察结果，溴化乙锭（EB）对人体有害等缺点。目前实验室常用于检测EMCV的 Real－time PCR主要有 Taq Man探针法和SYBR GreenⅠ染料法［16］。其中SYBR GreenⅠ是一种双链DNA结合染料，它结合到双链DNA后，可以使其荧光强度增加1 000倍以上，而不掺入双链中的染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。施开创［17］等针对脑心肌炎病毒VP1基因序列设计合成相应引物，建立的检测EMCV核酸的SYBR GreenⅠReal－time PCR方法经临床样品检测等验证，证明该法灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于EMCV的病原检测及定量分析。但是SYBR GreenⅠReal－time PCR也有其局限性，这是由于SYBR Green I容易非特异性地与所有双股DNA结合，因此反应体系中的引物二聚体、污染的基因组DNA以及其他非特异性扩增产物均会导致假阳性出现。而Taq Man real－time PCR 的优势在于利用上、下游引物及与目的模板互补的探针使反应的特异性具有双重保证，克服了SYBR GreenⅠ Real－time PCR存在假阳性的缺陷，从而可以确保检测结果的可靠性。

为探讨EMCV感染后促炎细胞因子的表达水平，从分子水平对EMCV的致病机制进行研究，陈宏备等［18］建立了检测小鼠IL－1β、TNF－α和管家基因β－actin的Taq Man real－time PCR 检测方法。结果表明，该方法线性关系很好，直线回归方程系数高；特异性强，仅以反转录得到的cDNA为模板，加入特异性引物及探针才可检测到荧光信号；重复性好，组内及组间变异系数均小于2%。该方法的建立不仅从分子水平，同时利用小鼠作为动物模型，为EMCV致病机制研究提供了必要的技术手段。施开创等［19］利用Taq Man探针法的优势，根据EMCV 3D基因的保守序列设计合成了相应引物及探针，建立了检测 EMCV 的 Taq Man real－time RT－PCR 方法，经实验结果可见该方法敏感性较高，比普通PCR高出100倍；特异性强，只能检测到以EMCV cDNA为模板的荧光信号，以其他病毒为DNA／cDNA为模板的荧光信号均检测不到；临床实验重复性、可靠性均较好。另外为探讨EMCV感染后IL－6、iNOS基因的表达水平，施开创等［20］针对小鼠IL－6、iNOS及管家基因β－actin的基因序列设计特异性引物和探针，建立的小鼠IL－6、iNOS和β－actin的Taq Man real－time荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强，重复性好，组内组间的变异系数均小于2%，可用于小鼠IL－6、iNOS基因的检测及定量分析。这些方法的建立为EMCV的临床诊断和流行病学调查提供一种更为特异、灵敏、快速的检测方法，同时为EMCV临床诊断及致病机理研究提供了有效技术平台。

3 小结

由于脑心肌炎病已经严重影响了养猪业的发展，该病疫情在世界许多地方均有发生与流行。因此，目前建立的各类EMCV检测方法是有效预防和控制本病的重要技术。只有能做到快速检测、精确诊断，及时控制传染源，切断传播途径，才能防止该病在猪群中的传播与流行。针对EMCV结构蛋白建立的ELISA方法适用于基层大批量样品的检测，但是不能区别疫苗免疫产生的抗体及野毒感染的抗体，因此限制了其广泛的使用；real－time PCR方法则是目前常用于实验室最为准确的检测方法，具有敏感、快速及可定量等优点，但是real－time PCR也有其局限性，如使用的仪器设备昂贵，只能适用于科研，不能在基层使用等，这些局限性限制了该法的大规模临床应用。建立一种有效的、能广泛适用于科研及基层的EMCV检测方法为脑心肌炎病的防控提供技术支持是新的发展方向。

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