酵母双杂交筛选人白细胞文库中与A型流感病毒PB1－F2相互作用的蛋白

崔雨明，侯佩莉，张茂林，李鸿梅，黄 飞，关振宏＊

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.吉林大学人兽共患病教育部重点实验室 人兽共患病研究所，吉林 长春 130062）

A型流感病毒（Influenza A virus，IAV）是严重威胁人类和动物生命健康的病原体之一，其高发病率和死亡率可对社会经济造成很大的影响[1]。IAV可感染包括人、哺乳动物、家禽及野生禽类等在内的多种宿主，其危害严重，曾引起20世纪的三次人际间的流感大流行，例如1918年－1919年的大流行中，全世界约有2000万以上的人死于流感。IAV属于正黏病毒科，其基因组由8条负链单股RNA节段组成，其中第1、2、3节段分别编码聚合酶蛋白PB2、PB1和PA。

2001年，Chen W 等[2]研究T细胞表位CD8＋时发现了IAV的第11种蛋白质——PB1－F2。该蛋白是由聚合酶亚单位PB1基因编码的，由87个左右的氨基酸组成。PB1－F2在绝大多数的IAV中都有发现，而在B型流感病毒中没有编码相似蛋白的基因片段[3]。它在宿主细胞中的存在时间非常短，一般在病毒感染后2h开始翻译，并且在5h达最大蛋白表达量[2]。研究发现PB1－F2主要定位在线粒体表面，但是其在某些病毒感染的细胞中的胞浆及核内都能发现。定位在线粒体上的PB1－F2能够与线粒体腺苷酸转位分子3（ANT3）和电压依赖的阴离子通道1（VDAC1）结合，改变线粒体膜通透性，释放细胞色素C而引起线粒体途径诱导的细胞凋亡[4]。进一步研究发现，PB1－F2主要引起免疫细胞的凋亡，这将导致抗原递呈和获得性免疫应答的降低，这是其致病性的重要因素[5]。PB1－F2还能直接与PB1相互作用，调节聚合酶的活性，导致病毒聚合酶的活性增强，从而增加RNA的积累，保证了病毒的充分复制[6]。

PB1－F2是流感病毒的一种重要毒力因子，病毒所致的高死亡率很可能与多种流感病毒毒株中都存在的 PB1－F2 蛋白有关[7－8]。McAuley J L等[9]研究发现PB1－F2作为一个新的流感病毒的毒力因子，能促进病毒感染后继发的细菌感染。AIV感染所致死亡率的主要原因实际是这些继发的细菌感染。Conenello G M等[10]比较病毒的氨基酸序列时发现，来自1997年香港和1918年西班牙的流感病毒PB1－F2蛋白的66位氨基酸由天冬氨酸转变为丝氨酸，这很可能是这两种病毒株高致死率的一个因素。

PB1－F2蛋白自被发现以来就倍受关注，许多研究都表明该蛋白在流感病毒的侵染过程中起重要作用，但是其影响病毒入侵、复制和致病作用的分子机理尚不清楚。本研究利用酵母双杂交系统，从人白细胞文库中筛选与PB1－F2蛋白相互作用的新宿主蛋白，为进一步深入研究其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pcDNA3.0／HA－PB1－F2、大肠埃希菌DH5α为吉林大学人兽共患病研究所病毒室保存。Matchmaker GAL4Two－hybrid System 3酵母双杂交系统、BD 克隆质粒 pGBKT7、AD 克隆质粒pACT2、酵母菌株AH109、人工合成营养缺陷型培养 基 SD／－Trp／－Leu／－His、SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade、X－α－半乳糖苷酶（X－α－gal）和人白细胞cDNA文库均购自Clontech公司；PEG 3350购自北京经科宏达生物技术有限公司，酵母质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；各种限制性内切酶、高保真Pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；鲑鱼精DNA、醋酸锂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母诱饵质粒 pGBKT7－PB1－F2 的构建根据GenBank上登录的流感病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）的PB1－F2的基因序列设计一对引物，引物序列如下：上游引物（带有EcoRⅠ酶切位点）：5′CGGAATTCATGGGACAGGAACAGGATAC 3′；下游引物（带有BamHⅠ酶切位点）：5′CGGGATCCCTAATACACAATCTGTTTGGG 3′。以pcDNA3.0／HA－PB1－F2 为模板，PCR 扩增目的基因，扩增条件是95℃5min变性后进入循环，94℃30s，58℃ 40s，72℃ 30min，30个循环，最后72℃延伸10min。然后将pGBKT7载体和PCR产物片段用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，用T4DNA连接酶16℃连接过夜，然后转入DH5α感受态细胞中，提取质粒后采用酶切法鉴定，并对所得候选阳性质粒进行DNA测序分析。

1.2.2 诱饵蛋白的自身激活检测 采用标准的醋酸锂法来制备感受态酵母细胞AH109，然后按照Clontech公司说明书上的方法将酵母表达载体诱饵质粒pGBKT7－PB1－F2转化到AH109感受态中，随机挑选含pGBKT7－PB1－F2 与 pGBKT7质粒的AH109酵母细胞单克隆，划线接种于SD／－Trp／－Ade／X－α－Gal，SD／－His／－Trp／X－α－Gal营养缺陷型培养板，30℃培养1周，观察其生长情况，检测诱饵蛋白有无自激活作用。将转化pGBKT7－PB1－F2和空载体pGBKT7的酵母细胞分别在SD／－Trp／Kan（20μg／mL）液体培养基中培养16h～24h，测定培养液的A600，进行诱饵蛋白的毒性检测。

1.2.3 诱饵蛋白表达的检测 分别挑取未转化载体的酵母菌和pGBKT7－PB1－F2阳性的酵母单克隆菌落接到SD／－Trp／Kan液体培养基中培养20h，用酵母蛋白提取试剂盒提取酵母总蛋白，通过 Western blot验证PB1－F2蛋白在酵母细胞中的表达。

1.2.4 酵母共转化法筛选与PB1－F2相互作用的蛋白 按照Clonteck公司Matchmaker System 3说明书进行。将白细胞cDNA文库和pGBKT7－PB1－F2诱饵质粒共转入酵母AH109感受态细胞中，其中文库质粒DNA 100μg、诱饵质粒75μg、鲑鱼精DNA 0.1mg，混匀后加入9mL无菌PEG／Li－Ac溶液（10%的10×TE，10%的10×LiAc，80%的50%PEG）中，30℃、200r／min振荡培养45min；加入1mL DMSO，42℃热激20min，置于冰上2 min，4000r／min离心3min；用15mL的无菌1×TE缓冲液重悬细胞，涂于四缺平板SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade上，于30℃ 培养3d～7d。同时在双缺平板SD／－Trp／－Leu上涂100μL 1∶100稀释的细胞，用于转化效率的计算。

1.2.5 酵母细胞内相互作用的重复验证 将四缺板上生长的转化子进行1轮SD／－Leu／－Trp／－His培养皿和 3 轮 SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－α－gal培养皿筛选，排除假阳性。再挑取生长良好、深蓝色的阳性克隆接种于四缺液体培养基中培养，提取酵母质粒并电转化至大肠埃希菌DH5α，含氨苄青霉素培养基中筛选克隆，PCR鉴定获得阳性转化子，提取质粒DNA，再重新与重组质粒pGBKT7－PB1－F2共同转化酵母菌株AH109，转化产物涂布于SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－α－gal，不能生长或生长菌落为白斑者作为假阳性克隆。进一步采用滤纸法定性检测β半乳糖苷酶报告基因的活性。将滤纸片平铺于培养皿中划出不同的区域，挑取培养皿上长势良好的克隆菌落均匀涂在滤纸片的不同区域，将滤纸片于液氮中反复冻融几次，向其中均匀加入10 mL Z buffer／X－Gal，30℃培养并观察颜色变化，变蓝的为阳性克隆。

1.2.6 基因测序分析 筛选出假阳性后的文库质粒经EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切后，选择有插段的样品送生物公司进行DNA测序，利用GenBank的数据库资源，运用BLAST应用程序进行序列分析。

2 结果

2.1 诱饵质粒pGBKT7－PB1－F2的构建及鉴定

A型流感病毒PB1－F2的全长基因与pGBKT7载体连接，构建的pGBKT7－PB1－F2质粒转化到大肠埃希菌DH5α中，PCR技术鉴定含重组质粒的阳性克隆；提取质粒并用EcoRⅠ／BamHⅠ双酶切鉴定（图1），片段大小相符。测序分析结果显示阅读框架无误，表明构建诱饵质粒成功。

图1 重组质粒pGBKT7－PB1－F2的PCR及酶切鉴定Fig.1 Identification of pGBKT7－PB1－F2plasmid by PCR and enzyme digestion

2.2 诱饵质粒pGBKT7－PB1－F2自激活效应检测和毒性检测

将诱饵蛋白载体pGBKT7－PB1－F2及空载体pGBKT7分别转化到感受态AH109酵母菌中，随机挑选几个单克隆菌落涂布营养缺陷型培养皿，30℃培养3d～5d。结果发现，包含pGBKT7－PB1－F2及空载体pGBKT7的酵母菌株在SD／－Trp／－Ade／－X－α－gal、SD／－Trp／－His／－X－α－gal培养板上都没有长出菌落，这表明pGBKT7－PB1－F2在该酵母双杂交系统中无自身激活作用，可以用于文库筛选。再将上述两种转化酵母菌分别在SD／－Trp／Kan液体培养基中30℃培养过夜，观察发现pGBKT7－PB1－F2及pGBKT7两个菌株生长情况都非常良好，其OD值比较接近，说明诱饵载体pGBKT7－PB1－F2对酵母细胞没有毒性，可以用于酵母双杂交文库筛选。

2.3 诱饵质粒蛋白在酵母中的表达

在SD／－Trp／Kan液体培养基中接入含有pGBKT7－PB1－F2诱饵质粒和无载体的酵母菌株，30℃培养过夜，收集沉淀用酵母蛋白提取试剂盒提取诱饵质粒阳性克隆酵母菌中的总蛋白，用c－Myc抗体进行Western blot检测，结果显示在相应分子质量处可检测到特异性条带，说明含诱饵质粒的酵母菌中有PB1－F2蛋白的表达（图2）。

2.4 白细胞文库中与PB1－F2相互作用蛋白的筛选

利用酵母双杂交系统以pGBKT7－PB1－F2质粒为诱饵蛋白筛选人白细胞cDNA文库。筛选出的阳性克隆在SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade／X－a－gal培养皿上反复筛选3次，四缺培养基划线筛选结果如下（图3），再经过β－半乳糖苷酶活性测定（图4），以排除假阳性克隆。之后将阳性克隆质粒进行EcoRⅠ／XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，可以看到不同大小的cDNA片段（图5）。选择电泳条带良好的阳性克隆质粒进行DNA测序，通过测序分析与NCBI GenBank数据库进行BLAST比对，合并序列完全相同的克隆，并剔除载体的阅读框与目的基因不同的克隆，最后共获得8种不同类别的基因（表1），包括各种酶、激酶、受体以及相关因子。

图2 Western blot检测 Gal4BD－PB1－F2融合蛋白在AH109中的表达Fig.2 Western blot analysis of the Gal4BD－PB1－F2 fusion protein expresed in AHl09

图3 四缺培养基筛选阳性克隆Fig.3 Screening of positive clones using QDO plates

图4 β－半乳糖苷酶活性测定Fig.4 Detection ofβ－galactosidase activity

图5 猎物质粒的酶切鉴定Fig.5 Identification of prey clones by enzyme digestion

表1 以PB1－F2为诱饵蛋白筛选白细胞文库获得的阳性克隆的BLAST结果Table1 The BLAST results of positive clones obtained from the screening of leukocyte cDNA library using PB1－F2as bait

3 讨论

PB1－F2是最近发现的AIV的一种重要毒力因子，越来越多的证据表明，这种蛋白具有多种生物学功能，包括诱导细胞凋亡，增强炎症反应和调节病毒聚合酶的活性，这些特性表现出一定程度的毒株和宿主特异性[11]。但是到目前为止，PB1－F2蛋白在病毒变异、复制和致病机制方面的确切机制还不清楚，因此研究该蛋白与宿主蛋白的相互作用，是研究蛋白分子作用机制的重要方面。

作为研究蛋白质相互作用的一种强有力的工具，酵母双杂交技术已被广泛应用于生物学的各个领域[12－14]。我们采用PB1－F2 基因全长作为诱饵进行蛋白质复合物筛选，共筛选出8种靶蛋白，主要包括酶、激酶、受体以及信号转导相关因子。表明PB1－F2在细胞内可以与多种蛋白相互作用，发挥调节细胞功能的作用。在这8个候选PB1－F2相互作用的蛋白中，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（G蛋白）是一组具有GTP结合、水解活性的蛋白质，在细胞膜受体和效应蛋白之间的信息传递过程中起中介作用，是细胞内一类重要的信号转导蛋白。G蛋白由3条蛋白链组成，按相对分子质量从大到小排列为Gα、Gβ和 Gγ，每一个亚单位也由多种亚型组成[15－16]。鸟嘌呤核甘酸结合蛋白β多肽2（GNB2）是G蛋白β亚单位的成员，是一种WD40结构重复的多功能蛋白，最近发现其在线粒体融合等方面发挥重要的作用[17－18]。研究表明G蛋白通过CCR5和CXCR4介导的信号传导在HIV复制过程中是非常重要的，所以深入探索G蛋白信号对病毒复制和疾病进程的作用是很重要的工作[19]。虽然目前关于GNB2的研究报道较多，但其在流感病毒感染方面还未见报道。

本研究中，我们筛选出与PB1－F2蛋白相互作用的8种靶蛋白，通过分析这几种蛋白已知的生物学功能及其信号传导途径，为探索PB1－F2蛋白功能和作用机理提供了新的方向，同时对流感病毒的防控具有极为重要的意义。PB1－F2与这些蛋白相互作用的生物学意义值得深入研究。

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