脱二氧乙酰甲喹及N4-脱一氧乙酰甲喹的合成及结构表征

汤有志，远立国，沈祥广

（1.华南农业大学兽医学院，广东省兽药研制与安全评价重点实验室，广东广州510642；2.华南农业大学兽医学院，广东广州510642）

乙酰甲喹（mequindox）又名痢菌净，化学名为3-甲基-2-乙酰基-喹喔啉-N1，N4-二氧化物，是20世纪80年代由我国自主研发的一类新兽药，主要用于治疗猪痢疾、鸡白痢等疾病［1］。因其价格低廉、具有较强的体内外抗菌活性，被广泛用于畜禽疾病的防治，但在使用过程中，鸡、猪中毒的事件时有发生。兽药等外源性化学物质的代谢物通常是导致动物中毒的主要原因。Liu Z Y 等［2］对喹喔啉N 氧化物类兽药喹乙醇的代谢物进行了系统研究，认为喹乙醇的毒性部分来自其代谢产物。乙酰甲喹具有与喹乙醇相似的喹喔啉母核结构，可能也具有与其相似的毒副作用。因而进行乙酰甲喹代谢产物方面的研究对准确评价其毒副作用、指导其临床合理用药、避免药物残留、保障食品安全显得尤为重要。

刘兆颖［3］对乙酰甲喹在肝微粒体中代谢物进行了相对定量，认为N4-脱一氧乙酰甲喹是乙酰甲喹在猪、鸡和大鼠肝微粒体中的主要代谢产物之一。尹伏军［4］则进行了氚标乙酰甲喹在大鼠、鸡和猪体内的吸收分布、排泄和代谢研究，最终确定脱二氧乙酰甲喹（3-甲基-2-乙酰基-喹喔啉）为乙酰甲喹在这三种动物体内的残留标示物。此外关于乙酰甲喹及其代谢产物报道多集中在针对其残留检测方法［1，5-6］、乙酰甲喹代谢酶的确定［7］及乙酰甲喹代谢产物的毒性等［8-10］方面的研究。而对于乙酰甲喹代谢产物的合成及结构确证工作则少有报道。乙酰甲喹、N4-脱一氧乙酰甲喹和二氧乙酰甲喹的结构式如图1。本文合成了N4-脱一氧乙酰甲喹和脱二氧乙酰甲喹，运用红外、核磁及质谱技术手段对上述两种乙酰甲喹代谢物进行了结构表征，结合乙酰甲喹的红外及核磁数据对上述两种乙酰甲喹代谢物进行了结构确证，以期为乙酰甲喹代谢产物及代谢规律的深入研究提供依据。

图1 乙酰甲喹、N4-脱一氧乙酰甲喹和脱二氧乙酰甲喹结构式Fig.1 Structures of mequindox，4-desoxymequindox and 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

1 材料与方法

1.1 材料

Bruker AV-300核磁共振仪，Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪（KBr压片），Aglient 6430质谱仪；乙酰甲喹原料药为广州惠华动物保健品有限公司产品；薄层层析用GF254硅胶板、柱层析用200～300目硅胶为青岛海洋化工厂产品；乙醇、保险粉（Na2S2O4）、三氯甲烷、石油醚（60℃～90℃）、乙酸乙酯等均为国产分析纯。

1.2 方法

参照喹烯酮代谢产物的合成方法［11］，并略有改进。

1.2.1 N4-脱一氧乙酰甲喹的合成 于100mL三口瓶中加入3g乙酰甲喹，60 mL 乙醇后加热至乙酰甲喹全溶，加入2.25g Na2S2O4，反应40min至乙酰甲喹大部分转化（TLC 监测反应，展开剂3∶1石油醚／乙酸乙酯），停止反应。将反应液蒸干，残渣加入30mL三氯甲烷，超声5min仍余少量淡黄色不溶物，加入约20 mL 水，不溶物基本全溶。以各20mL三氯甲烷洗深红色水相3次，合并有机相，以无水Na2SO4干燥后过滤，滤液加1g 100目～200目硅胶后减压蒸干，以使粗产物均匀吸附在硅胶上。200目～300目硅胶装柱，以5∶1石油醚／乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，得N4-脱一氧乙酰甲喹1.17 g，产率42.1% ；ESI-MS：m／z 203.2［M＋H］＋。

1.2.2 脱二氧乙酰甲喹的合成 于100mL三口瓶中加入2g乙酰甲喹，40mL乙醇后加热至乙酰甲喹全溶，加入1.5g Na2S2O4，反应40min至乙酰甲喹大部分转化（TLC监测反应，展开剂3∶1石油醚／乙酸乙酯），加入2g无水碳酸钾，3h后TLC显示中间产物完全转化为脱二氧乙酰甲喹，停止反应。加入30 mL～40mL水，使反应液中固体全溶，加入40mL三氯甲烷，震荡分层后分出有机相，以各20mL三氯甲烷洗水相3次，合并有机相。无水Na2SO4干燥后过滤，滤液加0.9g 100目～200目硅胶，减压蒸干有机相，以使粗产物均匀吸附在硅胶上。200目～300目硅胶装柱，以5∶1石油醚／乙酸乙酯为洗脱剂进行柱层析，得脱二氧乙酰甲喹0.9g，产率54.5%；ESI-MS：m／z 187.2［M＋H］＋。

1.2.3 红外光谱分析 将乙酰甲喹及1.2中所得两种代谢物分别进行红外光谱扫描。

1.2.41H核磁共振谱分析 以氘代氯仿为溶剂，将乙酰甲喹及1.2中所得两种代谢物分别进行核磁共振检测。

2 结果

2.1 红外光谱分析结果

将乙酰甲喹及1.2中所得两种代谢物分别进行红外光谱扫描，得3 种化合物红外谱图（图2～图4）。乙酰甲喹与N4-脱一氧乙酰甲喹在3 400cm-1处有一宽峰，可能为样品在进行溴化钾压片时干燥不够，引入水分产生的吸收峰。乙酰甲喹在1 700.02cm-1，N4-脱 一氧乙酰甲喹在1 706.19 cm-1，脱二氧乙酰甲喹在1 696.80cm-1分别有一峰形尖锐、强度较大的吸收峰，为分子中喹喔啉母核2号位取代羰基的吸收峰［12］。乙酰甲喹在1 330.60、1 341.52cm-1处，有分子中强度最大的吸收峰，为乙酰甲喹中两个N→O 基团的吸收峰；乙酰甲喹经Na2S2O4还原后生成N4-脱一氧乙酰甲喹，该化合物在1 327.58cm-1处有尖锐的吸收峰，且该峰强度与分子中羰基的吸收强度相近，表明乙酰甲喹中的一个N→O 基团已被还原失去与氮原子配位的氧原子，因而N4-脱一氧乙酰甲喹与乙酰甲喹相比，在该处少一个强度较大的吸收峰。乙酰甲喹还原体系中加入碳酸钾后，Na2S2O4还原性增强，能将乙酰甲喹上两个N→O 基团彻底还原，所得产物脱二氧乙酰甲喹分子中没有N→O 基团，故而在此处没有红外特征吸收。

图2 乙酰甲喹红外光谱图Fig.2 IR spectra of mequindox

图3 N4-脱一氧乙酰甲喹红外光谱图Fig.3 IR spectra of 4-desoxymequindox

图4 脱二氧乙酰甲喹红外光谱图Fig.4 IR spectra of 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

2.2 1 H核磁共振谱结果

以氘代氯仿为溶剂，将乙酰甲喹及1.2中所得2种代谢物分别进行核磁共振检测，得3种化合物核磁共振谱图（图5～图7）。图5中，0.000为内标四甲基硅烷分子中氢对应的化学位移、1.642 为H2O 在氘代氯仿中的化学位移、7.270为氘代氯仿中少量氯仿中氢的化学位移。芳环上甲基取代对其邻、间、对位氢的化学位移（δ）影响不大，乙酰基取代则会使苯环上剩余氢的δ 值变大而邻位变化最大［12］。此外，1，4位N→O 的强吸电子作用，会使喹喔啉母核电子云密度降低，导致5～8号氢尤其是与N→O 相邻，5，8号氢的δ变大。因而在乙酰甲喹分子中，8 号氢的位移最大，对应图5 中δ8.658～8.623；5号氢位移次之，对应图5 中δ8.586～8.553；6，7号氢对应δ7.914～7.861处的多重峰。1，4位N→O 对2，3号位的电子效应相同，而乙酰基中羰基的吸电子作用，会使与其邻位甲基的δ值大于3号位甲基。乙酰基中甲基对应δ＝2.745处单峰，乙酰甲喹分子中3号位甲基则对应δ＝2.550处单峰。以2.550处单峰积分为3.00，所得各氢原子个数与分子中氢原子分布相同。

由红外数据可知脱二氧乙酰甲喹分子中不含N→O 基团，比较图5与图7的1H核磁共振谱图，可知N→O 的存在使喹喔啉环上氢原子δ值变小，而使环上的3号位甲基及2号位乙酰基中甲基的δ值变大。图6与图5相比，分子中6、7、8号氢δ值变化较小（＜-0.03），而5 号氢δ值变化较大（～-0.4）。基于红外谱图已显示分子中保留有一个N→O 基团，我们认为该基团应位于喹喔啉母环的1号位，即4号位N→O 基团已被Na2S2O4还原。而喹喔啉母环上N→O 基团的减少，也使分子中两个甲基对应的δ值均有增加，而4号位N→O 基团被还原对3号位甲基的影响更大，因而会导致代谢产物中两个甲基间δ值差值的下降。这一点也在图6中得到体现（Δδ由0.195降至0.009）。由此可确定本文所得脱一氧乙酰甲喹为N4-脱一氧乙酰甲喹。

图6 N4-脱一氧乙酰甲喹1H核磁共振谱图Fig.6 1H-NMR spectra of 4-desoxymequindox

图7 脱二氧乙酰甲喹1H核磁共振谱图Fig.7 1H-NMR spectra of 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

3 讨论

药物代谢是药物在动物体内产生药效及毒性的重要过程，因而，药物代谢的研究对于指导用药具有极其重要的理论意义。乙酰甲喹作为我国自主研发的一类新兽药，主要用于食品动物疾病的防治，其代谢产物及代谢机制的研究对于避免其在食品动物中的残留具有重要意义。尽管本文合成得到了2种乙酰甲喹代谢物，但反应产率尚需提高。此外，尚需对乙酰甲喹可能的代谢产物进行逐一合成及光谱表征，最终确证其代谢产物，进而进行乙酰甲喹代谢方面的深入研究，为指导乙酰甲喹在食品动物上的使用及解决由此产生的食品安全问题提供理论依据。

［1］Liu Y，Si H，He L，et al.Identification of mequindox and its metabolites by high performance liquid chromatography combined with ion trap-time of flight-mass spectrometry［J］.Fenxi Huaxue，2010，38（1）：82-86.

［2］Liu Z Y，Huang L L，Dai M H，et al.Metabolism of olaquindox in rat liver microsomes：structural elucidation of metabolites by high-performance liquid chromatography combined with ion trap／time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications In Mass Spectrometry，2008，22（7）：1009-1016.

［3］刘兆颖.喹噁啉类在大鼠、猪和鸡的比较代谢研究［D］.湖北武汉：华中农业大学，2009.

［4］尹伏军.氚标乙酰甲喹的合成及其在动物体内的处置研究［D］.湖北武汉：华中农业大学，2010.

［5］Liu Y，Ding H，Liu Y，et al.Determination of main metabolites of mequindox excretion in chicken feces.［J］.Xumu Shouyi Xuebao，2011，42（1）：104-109.

［6］Duan Z，Fang G，Pan M，et al.Simultaneous determination of five quinoxaline-1，4-dioxides and two major metabolites in surface water by on-line solid phase extraction coupled to highperformance liquid chromatography［J］.Anal Methods，2011，3（8）：1821-1827.

［7］Liu J，Ge X，Ouyang M，et al.Catalytic characteristics of CYP3A22-dependent Mequindox detoxification［J］.Catal，2011，12（7）：637-643.

［8］Huang X，Wang X，Ihsan A，et al.Interactions of NADPH oxidase，renin-angiotensin-aldosterone system and reactive oxygen species in mequindox-mediated aldosterone secretion in Wistar rats［J］.Toxicology，2010，198（2）：112-118.

［9］Wang X，Huang X，Ihsan A，et al.Metabolites and JAK／STAT pathway were involved in the liver and spleen damage in male Wistar rats fed with mequindox［J］.Toxicology，2011，280（3）：126-134.

［10］Ihsan A，Wang X，Liu Z，et al.Long-term mequindox treatment induced endocrine and reproductive toxicity via oxidative stress in male Wistar rats.［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，252（3）：281-288.

［11］Li J，Zhang J，Zhou X，et al.Synthesis of the possible metabolites of quinocetone in animals.［J］.Heterocycl Commun，2007，13（1）：49-56.

［12］宁永成.有机化合物结构鉴定与有机波谱学［M］.北京：科学出版社，2000.