水栉霉营养成分检测及分析

2012-06-29东北林业大学野生动物资源学院巩玉辉于洪贤

中国饲料 2012年2期

东北林业大学野生动物资源学院巩玉辉于洪贤

黑龙江大学司法鉴定中心马玉堃＊

中国环境科学研究院王海燕

水栉霉是水体受到一定程度单、双糖或蛋白质污染的指示生物，是一种能在北方低温气候下生长繁殖的水生丝状真菌，菌体较大并能够结成絮状，其善于利用含糖有机污染物实现自身的物质代谢，生长和繁殖快速，无毒无害。本研究对水栉霉的概略养分及氨基酸、脂肪酸、矿物质元素成分进行测定分析，旨为水栉霉作为饲料资源的合理开发和利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及其培养水栉霉菌株（分离与牡丹江海浪河河夹大坝），保存于东北林业大学野生动物资源学院水生生物实验室，在PDA培养基上培养。

PDA培养基（菌种活化用培养基）：马铃薯去皮200 g切成小块，加水煮沸30 min，过滤，加18 g葡萄糖，用自来水定容至1000 mL。固体培养基则加入15 g的琼脂，121℃，灭菌20 min。

种子液培养基：淀粉2 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，FeSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L；115℃，30 min灭菌。

查氏液体培养基：蔗糖 30 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，FeSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1 L；115 ℃，30 min 灭菌。

优化培养基：碳源，氮源，K2HPO41 g，FeSO40.01 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，H2O 1L；最适pH，115℃，30 min灭菌。

1.1.2 试剂与仪器试剂：氯仿，甲醇，石油醚（60～90℃），乙醚，0.5 mL/LNaOH的甲醇溶液，0.5 moL/LNaOH，0.1 mol/L Tris HCL，硫酸，正已烷，盐酸，葡萄糖，蒽酮。

仪器：Varian 450-GC 240-MS，超声波清洗器，旋转蒸发仪（RE-52，上海亚荣生化厂)，恒温水浴锅，冷冻干燥机（FD-1A-50，北京博医实验仪器)，离心机（LD4-40，北京医用公司），灭菌锅（YXQ-LS-50S，上海博讯医疗厂），垂直流超净工作台（ZHJH-1109），摇床，氨基酸自动分析仪（日立 L-8800），电子天平（ALC-210.4），生化培养箱（HPS-250），显微镜（cx31 奥林巴斯），分光光度计，微波消解装置（功率为1 kW 的聚四氟乙烯型密闭消解容器），ICP发射光谱仪（美国PE公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 水栉霉的分离与培养挑取待分离的黏稠絮状物于75%乙醇中稍加浸泡，除去表面附着的其他微生物，放入100 mL含玻璃珠的无菌水中，摇床振荡30 min左右直至絮状物破碎，制成菌悬液，用无菌移液管从中吸取1 mL菌悬液移入装有9 mL无菌水的试管内，得到10-1梯度的菌悬液，按上述方法制备10-1～10-7梯度的菌悬液。分别用无菌移液管吸取1 mL不同梯度的菌悬液移入无菌平皿，然后倒入45℃的PDA培养基（适合霉菌类真菌生长）15 mL，迅速混匀成为平板培养基，待琼脂凝固后倒置平板，放入30℃培养箱中培养3 d。

挑取少量镜检结果吻合的目标菌落于事先制好的PDA平板上划线，划线时要在所划的范围内尽量划满，然后将接种环灼烧，再转动一定的角度连接已划线的区域再划另一区，最后划满整个平板培养后得到单菌落，重复多次平板划线最终得到纯菌，转斜面备用。在挑取单菌落时应注意最好选择单独的菌落，并应在菌落边缘挑取少量菌体，尽量不要带入原来的基质，划线时不要划破琼脂表面，整个过程均应无菌操作。

将分离纯化的水栉霉菌体接种于种子液中，30℃、140 r/min摇24 h制成种子液。以10%的接种量加入优化后的培养基中，30℃、140 r/min培养48 h得到最大菌体量。

1.2.2 概略养分的测定方法水分测定：GB/T 5009.03-2003；粗蛋白质：GB/T 5009.05-2003；粗脂肪：GB/T 14772-2003；粗纤维：GB/T 5009.10-2003。

1.2.3 氨基酸测定氨基酸：GB/T 5009.124-2003，日立 L～8800型氨基酸自动分析仪测定。

1.2.4 脂肪酸的测定氢氧化钾/甲醇碱催化甲酯化法：取粗脂肪样品50 μL至50 mL烧瓶中，加入正己烷+乙醚（2∶1，V/V）5 mL，0.5 mol/L氢氧化钾甲醇溶液3 mL，60℃恒温回流酯化反应20 min。加水 10 mL，摇匀，超声处理 1 min，取出移至离心管中，4000 r/min离心2 min，吸取上层脂肪酸甲酯，做 GC/MS分析（郑敏燕等，2010）。

1.2.5 矿质元素的测点用 HNO3+HClO4（3∶1，V∶V）混合酸作为消解剂进行样品消化，利用电感耦合等离子发射光谱法进行测定（赵清华等，2006）。

2 结果与讨论

2.1 概略养分分析由表1可见，烘干后的水栉霉中总糖含量高达61.69%，粗蛋白质含量较高为29.33%，粗纤维含量较低为10.06%。由此可见，水栉霉是一种营养丰富的水生真菌，可作为动物饲料较好的能量和蛋白质的来源。

表1 水栉霉的概略养分分析结果 %

2.2 氨基酸分析由表2可见，水栉霉中含有17种氨基酸，总氨基酸含量为15.73%，必需氨基酸含量为6.69%，含有生猪生长的9种必需氨基酸，并且生猪生长的第一限制性氨基酸赖氨酸的含量达到1.51%，比李如敏（1992）报道的生猪理想需要量高8.1个百分点。因此水栉霉作为新的菌类饲料，完全可以满足动物对蛋白质的需求。

2.3 脂肪酸分析采用φ（硫酸）=1的甲醇溶液酯化法对脂肪酸衍生化后，经过GC-MS分析，水栉霉的脂肪酸含量见表3。由表3可见，水栉霉的主要脂肪酸成分是十六烷酸、十八碳二烯酸、油酸、十八烯酸，其相对质量分数分别为17.24%、12.43%、20.67%、24.12%；其中不饱和脂肪酸相对质量分数为67.98%。水栉霉中还含有动物生长所必需的氨基酸,如花生四烯酸（相对含量1.92%）、十八碳二烯酸（相对含量12.43%）。