固态混菌发酵生产饲用复合酶制剂营养条件和培养条件的研究

浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所 许少春 李艳丽 柳 永 许尧兴＊

研究表明，饲料中添加复合酶制剂的饲喂效果优于单一酶制剂（李吉祥等，2007）。然而现在的复合酶一般是由单一酶复配而来的，应用成本较高。因此，研究复合酶的高效生产方法势在必行。本文在前期筛选获得高产α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的单一黑曲霉菌株的基础上，进一步对混合菌进行固态发酵条件研究，为复合酶制剂的高效产业化生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 菌种与培养基 黑曲霉变种（A.niger v.Tiegh CGMCC1182）为 α-半乳糖苷酶（α）生产菌株，酶活力可达245 IU/g（许尧兴等，2009）；黑曲霉MA-56（A.niger MA-56 CGMCC2722）为 β-甘露聚糖酶（β）生产菌株，酶活力可达1101 IU/g（李艳丽等，2009）；黑曲霉 XY-1（A.niger XY-1 CGMCC1182）为木聚糖酶（X）生产菌株，酶活力可达9478 IU/g（Xu 等，2008）。

斜面保藏培养基（PDA）：马铃薯 200 g/L，蔗糖20 g/L，琼脂20 g/L，自然pH。

混菌发酵基础培养基（M-M），根据三种酶单一生产的培养基配方进行组合确定：麸皮8 g，豆粕 2 g，玉米芯 2 g，魔芋粉 0.1 g，葡萄糖 0.5 g，（NH4）2SO40.2 g，NaNO30.2 g，MgSO40.1g，KH2PO40.2 g，H2O 11 mL。进行营养因子条件试验时，各成分的含量根据实际情况确定。

1.2 培养条件 将在PDA斜面上生长4～5 d的三种酶制剂的黑曲霉菌株的孢子用30 mL无菌水洗脱，并按1∶1∶1的比例制成混合孢子悬浮液。吸取2 mL孢子悬浮液至装有11 g（按干基质）发酵培养基的300 mL三角瓶中，并搅拌均匀。28～30℃培养56 h。

1.3 酶活测定

1.3.1 粗酶液制备 将发酵后的培养物于40℃烘干，粉碎。称取一定量的固体酶样，加入适量的水，40℃水浴抽提30 min，用滤纸过滤，滤液即为粗酶液。依据发酵产物中α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活高低，粗酶液再作适当的二次稀释供测定。

1.3.2 酶活测定 α-半乳糖苷酶采用许尧兴等（2004）的pNPG法并略作修改。取经适当稀释的酶液0.5 mL，加入0.1 mol/L pH4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.0 mL，5 mmol/L对硝基苯-D-α-半乳糖苷（pNPG，Sigma）0.5 mL，于 40 ℃水浴精确反应10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2.0 mL终止反应，于400 nm处测分光光度值。酶活力定义：在上述条件下，每分钟分解底物生成1 μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位（IU/g）。β-甘露聚糖酶和木聚糖酶酶活测定采用DNS法，测定条件为pH 5.5和40℃。一个单位的酶活定义为在测定条件下1 min内水解底物产生相当于1 μmol还原糖的酶量。

1.4 数据统计 运用SAS软件对数据进行统计分析，并在0.05水平上进行显著性检验。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基组成对黑曲霉混合菌发酵生产复合酶的影响

2.1.1 发酵培养基中麸皮、豆粕质量比对固态混菌发酵复合酶生产的影响 在发酵基础培养基中，其他因素不变通过改变麸皮与豆粕粉的质量比对复合酶产量的影响见图1。结果表明，麸皮与豆粕粉质量比在7∶3时，α-半乳糖苷酶酶活达到最大251 IU/g；麸皮与豆粕粉质量比在9∶1～6∶4时，β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活力都较高，且酶活相差不大，说明在一定范围内麸皮与豆粕粉的质量比对β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活力影响不大。综合α-半乳糖苷酶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶活力和价格因素，在以后的试验中选用麸皮与豆粕粉质量比为7∶3，三种酶制剂的活力分别可以达到 251、879、6144 IU/g。

2.1.2 玉米芯添加量对固态混菌发酵复合酶生产的影响 绝大多数产木聚糖酶菌株的产酶可以被木聚糖所诱导。玉米芯中木聚糖的含量可达35%以上，但玉米芯的添加对α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶的生产影响却是未知的。因此，以培养基中麸皮与豆粕粉质量比7∶3为基础，其他因素不变，研究了玉米芯不同用量对混菌发酵复合酶生产的影响，结果见图2。由图2可见，玉米芯的添加对α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶的生产有抑制作用，当培养基中玉米芯添加量在1.0 g以下时，二者酶活均平稳下降，而随着玉米芯添加量的逐渐增大，酶活呈急剧下降的趋势；但玉米芯的添加却对木聚糖酶的生产有激活作用，当培养基中玉米芯添加量在0.5 g时，木聚糖酶酶活显著上升，当玉米芯添加量在1.0 g时，木聚糖酶酶活仍继续上升，而随玉米芯添加量继续增加，木聚糖酶酶活基本趋于稳定。综合考虑玉米芯添加量在1.0 g时，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶活力可以达到酶活最优化，此时，三种酶制剂的活力分别可以达到225、781、7656 IU/g。

2.1.3 魔芋粉添加量对固态混菌发酵复合酶生产的影响 大多数微生物的β-甘露聚糖酶是诱导酶，只有在培养基中含有β-甘露聚糖时才进行β-甘露聚糖酶的合成。魔芋粉中含有44%～64%葡甘露聚糖，可以诱导β-甘露聚糖酶的生产，但对α-半乳糖苷酶和木聚糖酶的影响尚未考察。因此，根据2.1.1和2.1.2的结果，采用麸皮7 g，豆粕3 g，玉米芯粉1.0 g，其他因素不变，作为进一步进行研究的固态发酵培养基，对混菌发酵培养基中魔芋粉的添加量对复合酶生产的影响进行研究，结果见图3。由图3可见，混菌发酵培养基中添加魔芋粉，对黑曲霉α-半乳糖苷酶和木聚糖酶的酶活无显著影响；而培养基中添加0.1 g魔芋粉与不添加魔芋粉相比，β-甘露聚糖酶酶活力显著提高，但随魔芋粉的添加量继续增加β-甘露聚糖酶酶活基本趋于稳定，因此在以麸皮与豆粕粉质量为10 g为标准时，魔芋粉添加量为0.1 g，此时酶活力可以达到862 IU/g。

2.1.4 鱼粉添加量对固态混菌发酵复合酶生产的影响 黑曲霉α-半乳糖苷酶的纯菌发酵中，由于发酵结束之后，孢子数量多，在进行磨粉处理时会造成孢子在空气中挥散。经过试验，在发酵培养基中添加适量的鱼粉，可以在一定程度上抑制黑曲霉孢子的生长，但又不会造成α-半乳糖苷酶酶活的降低。因此，进一步对混菌发酵培养基中鱼粉的添加量对复合酶生产的影响进行研究，结果见图4。由图4可见，混菌发酵培养基中添加鱼粉，对α-半乳糖苷酶酶活没有影响，但却强烈抑制了β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活，虽然发酵产品烘干后孢子数量减少，但也相应降低了复合酶的酶活，由此可见，在黑曲霉混菌发酵进行复合酶生产时，混菌发酵培养基中不需要添加鱼粉。

2.1.5 无机氮源（NH4）2SO4和NaNO3对固态混菌发酵复合酶生产的影响 少量的NaNO3和（NH4）2SO4对黑曲霉木聚糖酶生产都有激活作用，而且NaNO3的诱导效果及其显著；NaNO3和（NH4）2SO4对黑曲霉β-甘露聚糖酶的生产都有轻微的抑制作用；NaNO3对黑曲霉α-半乳糖苷酶的生产有抑制作用，而（NH4）2SO4对α-半乳糖苷酶的生产却有激活作用 （许尧兴等，2009）。通过试验，确定 NaNO3和（NH4）2SO4的最适添加浓度，使混菌发酵的复合酶酶活达到最优化，结果见图5和图6。综合考虑α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶活力，当（NH4）2SO4添加量为

0.2 g，NaNO3添加量为0.1 g时，三种酶的酶活力可以得到最优化，此时三种饲用酶活力分别可以达到 216、772、9244 IU/g。

综合分析，黑曲霉混菌发酵生产饲用复合酶制剂的优化培养基配方为 （以麸皮和豆粕总量为10 g）计算：麸皮 7.0 g，豆粕 3.0 g，玉米芯 1.0 g，魔 芋 粉 0.1 g， 葡 萄 糖 0.5 g， （NH4）2SO40.2 g，NaNO30.1 g，MgSO40.1g，KH2PO40.2 g，H2O 11 mL。以下的培养条件试验就是以优化好的培养基配方为基础。

2.2 培养条件对黑曲霉固态混菌发酵生产复合酶的影响 前期研究表明，黑曲霉菌株纯菌发酵生产α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶时，培养温度、培养基含水量和装载量条件是一致的，在培养温度30℃时，当固形物与加水比1∶1，300 mL三角瓶中装量8 g培养基时各酶活达到最大值 （许尧兴等，2009； 李艳丽等，2009；Xu等，2008）。因此，在研究培养条件对黑曲霉混菌发酵生产复合酶的影响时不予改变。

2.2.1 接种比例对固态混菌发酵复合酶生产的影响 纯菌发酵时接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期，接种量小，延长菌体延迟期，发酵周期长，易染菌；但接种量过高往往又会使菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。混菌发酵进行饲用复合酶生产时，不同的接种比例也会对复合酶制剂当中单一酶的酶活产生影响，结果见图7。由图7可知，不同接种比例对复合酶中α-半乳糖苷酶的酶活基本无影响；当α∶β∶X 为 4∶5∶5时，β-甘露聚糖酶的酶活达到最高值883 IU/g，其次当 α∶β∶X 为 5∶6∶6 时，β-甘露聚糖酶的酶活可以达到 813 IU/g； 当 α∶β∶X 为 1∶2∶2时，木聚糖酶的酶活达到最高值9900 IU/g，其次当 α∶β∶X 为 5∶6∶6 时，木聚糖酶的酶活可以达到9767 IU/g。综合考虑α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶活力，当 α∶β∶X 为 5∶6∶6 时，可以达到酶活最优化，此时，三种酶制剂的活力分别可以达到 201、813、9767 IU/g。

2.2.2 发酵时间对混菌发酵复合酶生产的影响在获得了混菌发酵复合酶生产菌株接种比例的基础上，研究了不同培养时间对菌株合成饲用复合酶的影响。接种后从培养48 h起，每6 h取样，测定不同培养时间的各单酶产量，结果见图8。由图8可见，在试验的时间范围内，随着发酵时间的延长，α-半乳糖苷酶的酶活呈不断上升趋势，其中78 h时的酶活比60 h时的酶活提高了20%；β-甘露聚糖酶酶活在60 h之后达到了稳定；木聚糖酶则在60 h时达到第一个酶活高峰，此后随着时间延长，木聚糖酶酶活先是下降，66 h之后酶活又呈上升趋势，在72 h后酶活也达到了稳定。虽然木聚糖酶酶活出现两个产酶高峰，但第二个产酶高峰比第一个产酶高峰时间上延长了12 h以上，但单位酶活仅提高2%。综合分析发酵效率和发酵产量，将菌株复合发酵生产复合酶的时间定为60 h，此时三种酶制剂的活力分别可以达到221、894、10188 IU/g。

综合分析，黑曲霉混菌发酵生产饲用复合酶制剂的产酶最适培养条件为：培养温度30℃，固形物与加水比为 1∶1，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶接种比例为5∶6∶6，接种混合孢子悬浮液2.5 mL（以一支菌种斜面加30 mL无菌水为标准），300 mL三角瓶中装量8 g培养基，发酵60 h时，复合酶产量达到最优，α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶三种酶制剂的活力分别可以达到 221、894、10188 IU/g。

3 讨论

混菌发酵指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的DNA体外重组就可取得类似效果的新型发酵技术，其优点是可提高发酵效率甚至可形成新产品，因此，得到了广泛的应用（方浩等，2009；胡奎娟等，2007）。本试验中的三株黑曲霉菌株，虽然具有相似的遗传背景但却具有不同的生产性状，分别为α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶高产菌株，酶活分别可以达到245、1101、9478 IU/g。通过混菌发酵营养条件和培养条件研究，通过单次混菌发酵，发酵产物中α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的酶活分别可以达到221、894、10188 IU/g。 与纯菌发酵相比，混菌发酵产品中相对单一酶来讲，只有木聚糖酶酶活提高了7.50%，而α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶酶活分别比纯菌发酵降低了9.80%和18.80%。目前，在饲料中添加复合酶制剂成为一个趋势，但现在的复合酶一般是由单一酶复配而来的，提高了应用的成本。从表观上看，本次研究混菌发酵对试验的三种酶活的提高并没有起到作用，但从复合酶角度来讲，若想得到含有α-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的复合酶制剂产品，势必要对三种纯菌发酵的酶制剂进行复配，这样复配产品的获得一是需要进行三次纯菌发酵过程，二是通过复配之后（假设按 1∶1∶1进行配制），复配产品中单一酶制剂比纯菌发酵的酶制剂产品酶活要降低。对混菌发酵而言，复合酶产品只需要进行一次发酵过程，而且发酵产品中不但木聚糖酶酶活比纯菌发酵要提高，而且α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶酶活也只比纯菌发酵降低了9.80%和18.77%，优势明显。

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