糖尿病骨质疏松大鼠AGEs的表达及其与TGF-β1的相关性

单光宇 薛昊罡

(北华大学基础医学院解剖教研室，吉林 吉林 132021)

为了探讨糖尿病骨质疏松大鼠晚期糖基化终末产物(AGEs)的表达情况及其与组织生长因子(TGF)-β1的相关性，本研究对比了糖尿病组大鼠与正常对照组大鼠的AGEs与TGF-β1的表达情况，探讨TGF-β1在糖尿病骨质疏松保护作用中的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选择24只健康的Sprague-Dawley(SD)大鼠作为研究对象，均为6月龄，雌雄各半，体重(201.54±30.24)g，购自北华大学动物实验室，并饲养于北华大学实验动物中心清洁级环境，所有大鼠均饲养于塑料鼠盒中，派专人看护饲养，每笼4只，共6个笼子。所有大鼠均昼夜周期12 h环境中适应性饲养2 w，并任其自由摄入标准固体颗粒饲料和自来水。

1.2 方法 随机将SD大鼠分为正常对照组(n=12)和糖尿病组(n=12)，两组体重、月龄及喂养条件均无明显差异，具有可比性(P＞0.05)。其中正常对照组大鼠正常喂普通饲料和自来水，而糖尿病组大鼠则给予高糖高脂饲料喂养8 w。然后再禁食12 h后正常对照组腹腔注射等量枸橼酸缓冲液，糖尿病骨质疏松组大鼠一次性左下腹腔注射STZ 65 mg/kg。造模2 w后测定两组大鼠的血糖和体重来鉴定糖尿病造模是否成功〔1〕，采用4%戊巴比妥钠1 ml/kg腹腔注射麻醉下取下腔静脉血，4℃离心，吸取上清并保存于-70℃冰箱备用〔2〕。

1.3 检测指标 (1)血清学指标:采用Hitachi-850型荧光分光光度计测定血清中AGES的含量〔3〕。(2)骨组织中TGF-β1免疫组织化学染色:用大鼠椎体松质骨作为实验材料，石蜡包埋、切片，脱蜡入水后3%H2O2封闭内源性过氧化氢酶，使用1∶500山羊抗大鼠 TGF-β1多克隆抗体(福建迈新，克隆号为RAB-0238)作为一抗于37℃孵育1 h，使用1∶5 000生物素化驴抗羊IgG作为二抗于37℃孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.4 统计学分析 计量资料以x±s表示，单因素方差分析，组间均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 建模情况 12只糖尿病组大鼠中1只死亡，1只建模失败，最终糖尿病组造模成功10只。注射STZ前，糖尿病组大鼠的体重在8 w后明显高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);而在注射STZ后糖尿病组大鼠的体重增长明显缓慢，至20 w实验结束时体重明显低于正常对照组(P＜0.05)。注射STZ后糖尿病组大鼠的血糖较对照组大鼠明显升高，且差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1，表2。

2.2 两组大鼠血清AGEs水平比较 糖尿病组大鼠造模后，血清AGEs含量为(5.81±1.20)U/ml;对照组大鼠的血清AGEs含量为(1.28±3.37)U/ml，两组比较差异具有统计学意义(t=6.57，P ＜0.05)。

2.3 两组大鼠TGF-β1蛋白表达比较 正常对照组大鼠骨组织TGF-β1蛋白表达强且广泛，而糖尿病组亦出现TGF-β1蛋白的阳性表达，但是糖尿病组的TGF-β1表达均散而且淡染。见图1。将两组的TGF-β1表达使用Image J软件进行统计，发现糖尿病组的TGF-β1蛋白表达染色平均光密度(2.11±0.43)明显低于对照组(4.32±0.74)，且组间比较差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表1 注射STZ前后两组大鼠空腹体重变化比较(x ± s，g)

表2 注射STZ前后两组大鼠空腹血糖变化比较(x ± s，mmol/L)

2.4 大鼠血清AGEs与TGF-β1的相关性分析 血清AGEs与TGF-β1呈显著负相关，相关系数为-0.693(P＜0.05)。

图1 两组大鼠骨组织的免疫组化染色(×400)

3 讨论

糖尿病可引起患者多个系统损害，引起功能缺陷及衰竭〔3〕。到目前为止，糖尿病骨质疏松的发生机制和相关影响因素尚未完全明确。近年来，有学者研究发现糖尿病骨质疏松可能与AGEs引起骨代谢紊乱有关〔4～6〕。本文研究结果显示糖尿病组大鼠造模后，糖尿病组大鼠的血清AGEs水平明显高于对照组。这主要是由于AGEs抑制间充质干细胞(MSCs)增殖，诱导凋亡，并阻止其分化为脂肪组织、软骨和骨组织，结果导致骨组织(如弹性胶原)理化和机械特性的改变〔7〕。另外，还有一些学者对骨质疏松与TGF-β1的关系进行了研究。有学者发现在去卵巢后6 w，大鼠骨中的TGF-β1含量即有明显下降，认为雌激素缺乏引起的TGF-β1耗竭导致进一步的TGF-β1的分泌减少，而用生理浓度的17β-雌二醇治疗可以使 TGF-β1含量上升〔8～10〕。为了探讨糖尿病大鼠骨质疏松中AGEs与TGF-β1的相关性。本研究对正常对照组和糖尿病组大鼠血清中AGEs水平与骨组织TGF-β1水平进行了分析研究，结果显示二者呈显著负相关。这表明通过抑制AGEs而引起TGF-β1的过表达在糖尿病中起到骨保护的作用。

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