益气活血法改善缺血性脑卒中急性期大鼠微循环障碍的机制

邱 乐 王新生 刘 擎

(解放军458医院，广东 广州 510602)

中风分为出血性中风和缺血性中风。在我国，约85%的缺血性中风急性发作(acute ischemic stroke，AIS)具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多的特点。有研究表明AIS患者气虚血瘀证达73%，故益气活血法是AIS的重要治疗方法，尤以黄芪注射液和灯盏细辛注射液为临床常用药物。本研究通过复制AIS大鼠模型，研究黄芪注射液和灯盏细辛注射液对改善AIS大鼠微循环的作用机制，为指导AIS的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康老年SD大鼠60只，体质量(270±30)g(广州中医药大学实验动物中心提供)。治疗用药:①黄芪注射液〔10 ml/支(相当于原药材20 g)，国药准字Z33020179，正大青春宝药业有限公司〕;②灯盏细辛注射液(10 ml/支，国药准字Z53021569，云南生物谷灯盏花药业有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将60只SD大鼠随机取15只做假手术组;余行AIS模型制备，术后45只随机取15只做模型组，余30只为治疗组。

1.2.2 模型制作 采用多因素复合方法复制气虚血瘀证动物模型，颈总动脉结扎并改良线栓法复制脑缺血动物模型。

1.2.2.1 气虚血瘀模型 参照文献〔1〕，采用饥饿、冷水疲劳游泳结合高脂饮食的方法造模。①饥饿:先测得大鼠正常饮食量，仅按正常饮食量60%喂养。②冷水疲劳游泳:将大鼠每日于水温(10±0.2)℃、深30 cm水桶中，棒打促使其持续游泳，至疲劳开始下沉时捞出，自然风干，不采取保暖措施。③高脂饮食:上述步骤处理后，再予脂肪乳灌胃，剂量按大鼠体重系数折算，予10 ml/kg灌胃，1次/d。以上方法持续7 d。造模成功标准:精神萎靡，倦怠嗜睡，毛发无光泽或结穗或稀疏脱落，稀便，舌淡或紫暗，眼球暗红，四肢或尾部出现瘀点瘀斑等。

1.2.2.2 大鼠局灶性脑梗死模型 参照文献〔2，3〕，采用颈总动脉结扎并改良线栓法造模。所有造模大鼠术前均禁食1 d，予腹腔内注射20%乌拉坦(900 mg/kg)麻醉，仰卧位固定大鼠，颈部常规备皮消毒后，沿颈部正中切开，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露并分离右侧颈总动脉与迷走神经，于近颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉。夹闭颈总动脉、颈内动脉。近颈总动脉分叉约5 mm处针刺破入并将栓线插入颈总动脉，松开微动脉夹，将插线插入颈内动脉，进线深度(19±0.5)mm。将栓线与颈总动脉结扎固定，消毒术区，缝合筋膜、皮肤。外用甲硝唑粉预防感染。假手术组除不插栓线外，其余手术步骤同模型组。造模成功的标准:苏醒后左上肢屈曲，行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪，或伴右侧Horner征。不符合标准的动物剔除。

1.2.3 给药方法 各组大鼠均于造模成功10 min后给药，剂量参考人与大鼠体重系数折算标准〔4〕。治疗组予以腹腔注射黄芪注射液(3.2 ml/kg)及灯盏细辛注射液(3.6 mg/kg)，假手术组与模型组腹腔注射等量生理盐水;每日1次，疗程4 d。室温下饲养，自由饮食饮水，自然昼夜。

1.2.4 观察指标 各组大鼠分别于治疗前后检测血管内皮素(ET)、5-羟色胺(5-HT)、D-D 二聚体(D-Dimer，D-D)、血栓烷素A2(TXA2)、前列环素(PGI2)、热休克蛋白70(HSP70)mRNA;并在治疗 0、12、24、48、72、96 h 分别作大鼠神经功能 ZeaLonga评分。

1.2.4.1 大鼠神经功能ZeaLonga评分〔1〕①无神经功能缺失症状，活动正常(0分);②不能完全伸展对侧前爪(1分);③动物爬行时出现向左转圈(追尾现象)(2分);④身体向偏瘫侧倾倒(3分);⑤不能自发行走，意识丧失(4分)。分别剔除评分为0分和4分者。

1.2.4.2 检测方法 运用放射免疫法测定血浆 ET、TXA2、PGI2水平，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆D-D水平，以RF-510型荧光分光光度计测定大脑皮层5-HT水平，用Northern印迹检测脑组织HSP70 mRNA水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示，组间均数比较采用t检验;神经功能缺损评分采用重复测量资料的方差分析;各微循环指标治疗前后比较采用析因设计资料的方差分析。

2 结果

2.1 大鼠神经功能ZeaLonga评分 模型组96 h评分与同组12 h评分差异有统计学意义(P＜0.05)，治疗组72、96 h评分与同组24 h评分，治疗组96 h与同组48 h评分差异有统计学意义(P ＜0.05);且治疗组 24、48、72、96 h评分与模型组同一时点评分差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 微循环指标 (1)各组内比较:模型组治疗后的5-HT、TXA2、HSP70 mRNA水平与治疗前比较均有显著差异(P＜0.05)，表明AIS部分微循环指标可于发病4 d内的非治疗状态下自行缓解;治疗组治疗后的各指标水平与治疗前比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，表明益气活血法对AIS各微循环指标均有不同程度的改善作用。(2)各组间比较:治疗前的假手术组各指标水平与模型组、治疗组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，表明所选大鼠造模成功后AIS微循环障碍的各指标均有不同程度恶化;治疗后治疗组的ET、D-D、TXA2、HSP70 mRNA水平与模型组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，表明益气活血法对AIS部分微循环指标的改善优于其自行缓解;治疗后的治疗组D-D水平与假手术组无显著差异(P＞0.05)，表明益气活血法治疗后，D-D水平可改善至近似发病前的正常水平。见表2。

表1 各组大鼠不同时点神经功能ZeaLonga评分比较(x±s)

表2 治疗前后各组微循环指标比较(x±s)

3 讨论

AIS脑损伤的主要机制为兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、炎症反应、线粒体损伤，而微循环损伤是其核心之一。ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA为反映微循环障碍及由此引起神经元损伤的重要指标。

AIS的缺氧和机体应激反应能迅速诱导脑组织ET高表达，导致脑微循环功能紊乱及由此所致的神经元损伤。ET一方面可致脑血管强烈收缩痉挛，脑血流量急剧下降而致脑组织缺血缺氧，导致和加重脑缺血再灌注损伤;另一方面对神经细胞产生细胞毒性作用，加剧脑水肿的发生发展，造成脑组织的严重损伤〔5〕。

5-HT为内源性的血管活性因子，也是中枢神经系统重要的神经递质，具有重要的血管活性作用〔6〕。缺血性脑损伤的单胺递质假说认为:①脑缺血可致细胞外5-HT浓度迅速升高。有研究发现全脑缺血后多个脑区均存在单胺类递质紊乱，进一步揭示了单胺类递质与脑缺血损伤之间的密切联系。②脑缺血时血小板活性增高，释放功能增强，也可致5-HT升高。③5-HT可通过直接兴奋血管平滑肌的5-HT2受体，增强其他内源性缩血管物质作用以及促进肾上腺能神经元末梢释放去甲肾上腺素而使脑血管收缩，加重脑组织缺血损伤。

D-D是交联纤维蛋白在纤溶酶作用下产生的一种特异性的最终降解产物。D-D升高表明血栓形成和溶解均增强，高水平D-D可预示缺血性脑血管疾病的发生。凝血酶水解纤维蛋白原产生可溶性纤维蛋白单体(SFM)，进而形成具有稳定、坚固、不再溶解特点的交联纤维蛋白，故而凝血;纤维凝血6 h后血栓即发生继发性纤维蛋白溶解，纤溶酶降解纤维蛋白原、SFM及关联纤维蛋白，D-D就是其中一种降解产物。D-D增高提示继发性纤溶活性增强，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的特异性血液学分子标记物〔7〕。

TXA2和PGI2为调节血管张力的一对天然的拮抗物，都具有重要的血管活性作用。TXA2是由血小板微粒体合成并释放的一种具有强烈促进血管收缩和血小板聚集的生物活性物质，PGI2是由血管内皮细胞合成并释放的一种具有抗血小板聚集和舒张血管的生物活性物质。正常情况下，二者在脑组织内保持动态平衡，以维持脑血管稳定和血流通畅。脑缺血时，Ca2+超载致花生四烯酸(AA)明显增多;再灌注时，脑组织内堆积的AA经环氧合酶生成不稳定的中间代谢产物PGG2和PGH2，再经过合成酶催化分别生成TXA2与PGI2。但再灌注期间脑组织产生的大量氧自由基可损伤血管内皮细胞，抑制PGI2合成酶，使得PGI2减少而TXA2合成相对过多，导致TXA2/PGI2比例失衡，脑组织微循环障碍进一步加重，出现继发性缺血、缺氧，加重脑继发性损害〔8〕。

HSP是一类在进化上高度保守、在机体发生应激反应时诱导产生的保护性蛋白，其中HSP70是HSP家族中最主要的一类〔9〕。动物实验表明，HSP70对脑缺血受损的神经元有神经保护作用，可能与其作为伴侣蛋白促进蛋白质正确折叠、抑制细胞凋亡等作用有关〔10〕。黄芪注射液等许多药物能诱导HSP70表达升高或降低，通过不同的途径起到神经保护作用〔11〕。

AIS所致的微循环障碍以及由此所致的神经元的损伤，都会导致 ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA 的高表达以及比例失衡。故而针对上述指标的研究，可以反映药物对AIS缺血损伤时脑微循环障碍及神经功能缺损的改善作用。

AIS属祖国医学“中风”范畴。清代医家王清任认为，“元气既虚必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀”，因而提出中风的气虚血瘀论。临床研究表明，气虚血瘀证为中风的主要中医证候，故益气活血法是AIS的重要治疗方法。黄芪注射液及灯盏细辛注射液为益气活血法的临床常用药物;黄芪注射液为黄芪提取物制成的针剂，具有补气升阳、利水消肿作用〔12〕;灯盏细辛注射液为灯盏细辛经提取酚酸类成分制成的灭菌水溶液〔13〕，功以散寒解表、祛风除湿、活血化淤、通络止痛。临床研究报道，两者合用可明显降低血浆纤维蛋白原水平，改善血液循环状态，从而减轻神经功能缺损，改善患者临床症状，且安全性高。

本研究结果提示，AIS发病后4 d内其整体神经功能有明显的自行缓解作用;发病后24～96 h，益气活血法对AIS整体神经功能的改善优于其自行缓解过程，且发病后4 d内益气活血法对AIS整体神经功能的改善逐渐明显。

本研究提示，以黄芪注射液及灯盏细辛注射液为代表的益气活血法，能够改善AIS的整体神经功能评分;ET、5-HT、D-D、TXA2、PGI2、HSP70 mRNA高表达是AIS微循环障碍的重要机制与指标，益气活血法能够通过调整各微循环障碍指标的表达，尤其下调D-D的高表达，改善AIS微循环，从而促进整体神经功能的恢复。今后研究有待于深化AIS微循环改善的具体机制，进一步推广益气活血法治疗AIS的临床应用。

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