Caspase-3参与白花败酱草皂苷诱导Hela细胞凋亡

张 涛 田黎明 朱贵明 任继秋 张 宇 田丽华

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

白花败酱草是败酱科草本植物的根茎及带根全草，在中国的华东、华中、华南及西南各地均有分布，是一种常用植物药。白花败酱草具有清热利湿、解毒排脓、活血化瘀、清心安神、改善肝功能、抑菌和抗病毒等作用。关于黄花败酱体内抗肿瘤，体外诱导人乳腺癌(MCF-7)细胞凋亡的作用曾有报道〔1〕，但白花败酱草及其总皂苷在抗肿瘤方面的作用，较少报道〔2〕。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂 人宫颈癌Hela细胞株由哈尔滨医科大学微生物教研室赠送;RPMI-1640干粉培养基(美国Gibco公司);新生牛血清(杭州四季青公司);AB8大孔吸附树脂购于天津南开大学化工厂。

1.2 方法

1.2.1 实验药材与处理 白花败酱草购于秦皇岛市民乐医药公司，由安国市昌达中药材饮片有限公司提供。

1.2.1.1 白花败酱草水提物的制备〔3〕白花败酱草粉碎后加适量水，浸泡3 h，煮沸提取60 min，收集药液，经旋转蒸发仪50℃减压回收得白花败酱草水提液，真空干燥箱55℃干燥，得败酱草水提物固体干粉。

1.2.1.2 白花败酱草总皂苷的制备 取干燥的白花败酱草4 kg，粉碎，按1∶10用70%食用酒精浸泡4 h，加热回流提取2次，合并滤液减压回收乙醇，得白花败酱草乙醇粗提物。此粗提物加入石油醚脱脂，用AB8大孔吸附树脂层析分离总皂苷。白花败酱草醇提物上层析柱后用蒸馏水洗脱至洗脱液中无糖为止(Molish反应阴性)。再分别用30%、50%和70%乙醇洗脱，收集洗脱液，至各洗脱液Liberman-Burchard反应阴性为止。洗脱液减压回收乙醇，真空干燥得淡黄色粗提物，终重量为25.2 g，白花败酱草总皂苷的提取率约为0.63%。皂苷鉴定∶取少量干燥提取物，与浓硫酸-醋酐(1∶20)反应显蓝绿色，证明提取物为甾体皂苷〔3〕。

1.2.2 细胞培养 Hela细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，置于37℃，50 ml/L CO2、饱和湿度恒温培养箱中孵育，每2～3 d传代。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制作用 水提物终浓度分别为 0.20，0.40，0.80，1.20 mg/ml;皂苷终浓度分别为0.05，0.10，0.15，0.20 mg/ml。另设未加药物只加细胞的对照组，每个浓度设三个复孔，诱导48 h。细胞生长抑制率=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。根据各组药物对细胞的抑制率，运用SPSS10.0软件计算出药物半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3.2 光镜观察Hela细胞凋亡的形态学特征 皂苷0.15 mg/ml，水提物1.20 mg/ml，阴性对照组培养48 h后，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，4%多聚甲醛固定，4℃过夜。苏木素-伊红(H-E)染色，光镜观察拍照。

1.2.3.3 电镜观察Hela细胞超微结构的变化 用皂苷0.15 mg/ml处理Hela细胞48 h和72 h后，树脂包埋，烘烤24 h固化成硬块，切成超薄切片(50 nm)，醋酸铀-枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察细胞超微结构。

1.2.3.4 Hela细胞Caspase-3活性的检测 皂苷终浓度为0.15、0.20 mg/ml，水提物终浓度为 0.80、1.20 mg/ml，每个浓度设3个复孔，同时设阴性对照，按试剂盒说明书操作，酶标仪测定OD405值，通过计算OD给药组/OD阴性对照的倍数来确定各组Caspase-3的活化程度。

1.3 统计学方法 应用SAS9.13软件分析，实验数据以x±s表示，组间差异的显著性先方差分析，再采用Dunnet't检验。

2 结果

2.1 白花败酱草皂苷和水提物对Hela细胞生长的抑制作用总皂苷和水提取物的 IC50值分别是 59.2μg/ml和199.9μg/ml。根据美国国家癌症中心(NCI)标准:IC50≤230μg/ml可作为抗肿瘤药物，说明白花败酱草总皂苷和水提物对Hela细胞有明显的细胞毒作用。见表1，表2。

2.2 白花败酱草总皂苷诱导Hela细胞的形态学变化

2.2.1 HE染色光镜观察结果 光镜下可见对照组的Hela细胞生长良好，细胞呈多边形，细胞质多，胞核染色质疏松，染色较淡;皂苷0.15 mg/ml及水提物1.20 mg/ml诱导 Hela细胞48 h后，细胞生长受到不同程度的抑制，出现胞体变圆，胞质起泡，染色质凝集深染等。见图1。

表1 白花败酱草总皂苷对Hela细胞生长的抑制作用

表2 白花败酱草水提物对Hela细胞生长的抑制作用

图1 HE染色光镜观察结果(×100)

2.2.2 电镜观察结果 电镜下可见对照组Hela细胞膜表面有较多微绒毛，染色质疏松，核仁明显。皂苷0.15 mg/ml诱导Hela细胞48 h和72 h后，可见细胞变小，细胞膜表面微绒毛消失，出现早期细胞凋亡的染色体边集，细胞质中空泡化明显，可见含致密染色质和细胞膜的凋亡小体。见图2。

图2 电镜观察Hela细胞形态(TME，×6 000)

2.3 败酱草皂苷和水提物对Hela细胞Caspase-3活性的影响用白花败酱草总皂苷和水提物诱导Hela细胞48 h后，各诱导组Caspase-3活性比对照组均有显著增高，总皂苷0.15 mg/ml和水提物1.2 mg/ml激活Caspase-3活性分别是对照组的3.70和2.42倍。见表3，表4。

表3 败酱草总皂苷对Hela细胞Caspase-3活性的影响

表4 败酱草水提物对Hela细胞Caspase-3活性的影响

3 讨论

有研究表明多种皂苷具有明显的抗肿瘤活性〔4，5〕，本实验白花败酱草总皂苷和水提物对Hela细胞生长均有明显的抑制作用，表明Hela细胞对白花败酱草皂苷的抑制作用敏感，初步确定皂苷是白花败酱草有效的抗肿瘤活性成分。

诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新靶点。细胞凋亡时具有典型的形态和生化特征〔6〕。细胞凋亡受多种基因调控，并与Caspases家 族 和 Bcl-2家 族 密 切相关〔7〕。Caspases为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶的简称，是一组具有相似氨基酸顺序和二级结构的半胱氨酸蛋白酶，参与细胞因子成熟、细胞生长和分化，还与细胞凋亡密切相关。Caspases级联反应在凋亡通路中处于重要地位，尤其 Caspase-3是其中的中心环节，Caspase-3被认为是细胞凋亡过程中最关键的效应蛋白酶，而Caspase-3催化一些底物的降解是导致染色质浓缩的关键步骤〔8〕。本实验表明白花败酱草总皂苷通过诱导Hela细胞的凋亡，达到其抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用;白花败酱草总皂苷和水提物诱导 Hela细胞凋亡的同时，各诱导组细胞中Caspase-3活性也比对照组明显增高，说明Caspase-3参与白花败酱草皂苷诱导Hela细胞凋亡的作用，有关白花败酱草皂苷诱导肿瘤细胞凋亡是否通过线粒体或内质网途径，尚待进一步研究。

1 沈德凤，杨 波，李进京.黄花败酱总皂苷提取物抗肿瘤作用的实验研究〔J〕.黑龙江医药科学，2007;30(3):35-6.

2 陈 磊，张 涛，田黎明，等.白花败酱草提取物对小鼠U14宫颈癌细胞的抑制作用〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(8):1091-3.

3 徐洁昕，周方钦，江放明.白花败酱总皂甙提取工艺研究〔J〕.山东中医药大学学报，2005;29(3):227-9.

4 Siu FM，Ma DL，Cheung YW，et al.Proteomic and transcriptomic study on the action of a cytotoxic saponin(Polyphyllin D):induction of endoplasmic reticulum stress and mitochondria-mediated apoptotic pathways〔J〕.Proteomics，2008;8(15):3105-17.

5 Ma DD，Lu HX，Xu LS，et al.Polyphyllin D exerts potent anti--tumour effects on lewis cancer cells under hypoxic conditions〔J〕.JInt Med Res，2009;37(3):631-40.

6 Kaufmann SH，Earnshaw WC.Induction of apoptosis by cancer chemotherapy〔J〕.Exp Cell Research，2000;256(1):42-9.

7 Soto Cerrato V，Llagostera E，Montaner B，et al.Mitochondria-mediated apoptosis operating irrespective of muthidrug resistance in breast cancer cells by the anticancer agent prodigiosin〔J〕.Biochemical Pharmacol，2004;68(7):1345-52.

8 Way TD，Kao MC，Lin JK.Degradation of HER2/neu by apigenin induces apoptosis through cytochrome c release and caspase-3 activation in HER2/neu-overexpressing breast cancer cells〔J〕.FEBSLett，2005;579(1):145-52.?