Survivin基因沉默对结直肠癌PTTG mRNA的影响

史美龙

(吉林省人民医院基本外科，吉林 长春 130021)

Survivin基因属于凋亡抑制基因家族，Survivin蛋白在人结肠癌组织以及细胞株中均显著高表达，与结直肠癌的发生发展、侵袭转移及血管形成有关，已成为具有潜在价值的肿瘤生物学标志物和肿瘤治疗的新靶点〔1，2〕。本课题前期构建了靶向干扰Survivin的小发卡RNA(shRNA)，并对Survivin基因沉默后结直肠癌的生物学行为进行了评价，发现其能够明显抑制结直肠癌细胞增殖〔3，4〕。在前期研究工作的基础上，本研究利用已经构建成功的重组载体，探讨Survivin基因沉默后垂体瘤转化基因(PTTG)mRNA的表达，旨在为阐明Survivin在结肠癌发生发展中的作用及基因治疗的应用方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 结直肠癌Lovo细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所。RPMI1640培养基购自Gibco公司，转染试剂脂质体lipo2000购自Invitrogen公司，质粒小提试剂盒购自Promega公司。重组质粒pGenesil-2-对照(非同源干扰序列插入pGenesil-2)和pGenesil-2-Survivin 1(插入靶向Survivin基因5'-GGACCACCG CATCTCTACA-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体)以及pGenesil-2-Survivin 2(插入靶向Survivin基因5'-GGCTGGCTTCATCCACTGC-3'目的片段干扰序列的pGenesil-2干扰载体)由本实验室构建。

1.2 质粒抽提 将本实验构建的重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2接种于50 ml LB培养液中，37℃、250 r/min振摇培养16 h。运用质粒抽提试剂盒抽提质粒DNA，按照试剂盒说明书进行。

1.3 细胞转染 运用含10%胎牛血清在37℃、5%CO2培养箱中培养Lovo细胞。将细胞接种于6孔板中，接种密度约为5×105个/孔。运用脂质体Lipo 2000转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1 和 pGenesil-2-Survivin 2，转染方法按照Lipo2000说明书进行。

1.4 实时荧光定量PCR 于转染后0、24、48和72 h收集细胞，运用Trizol法按照操作说明书提取总RNA(购自北京百泰克生物科技有限公司)，运用反转录试剂盒(购自Fermentas公司)逆转录为cDNA，-20℃保存。特异性引物用于实时荧光定量PCR检测Survivin和PTTG的表达。Survivin引物:上游:5'-GCCAGATTTGAATCGCGGGA-3';下 游:5'-GCAGTGGATGAAGCCAGCCT-3'，产物片段长度为185 bp。PTTG引物:上游:5'-AGTTTCAACCACGTTTTGGC-3';下游:5'-CTTTTCAAGCT CTCTCTCCT-3'，产物片段长度为352 bp。管家基因GAPDH引物，上 游:5'-CCAATATGATTCCACCCATG-3';下 游:5'-GAGAAGGCTGGGG CTCATTT-3'，产物片段长度为195 bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。

20μl反应体系中含 cDNA样品2.0μl，SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10.0 μl，上、下游引物(20 pmol/μl)各0.2 μl，去离子水补足20μl。Eppendorf实时荧光定量PCR仪上设置95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃延伸60 s，共40个循环。以GAPDH为内对照。将 cDNA 液按101、102、103和104、105梯度稀释后，各取2μl进行实时荧光定量PCR反应，检测目的基因和GAPDH的扩增效率，Ct值为荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)。采用比较循环阈值法(2-ΔΔCt)分析样本中Survivin和PTTG的相对含量〔5〕。具体计算方法如下:以加入Lipo2000转染试剂组作为正常对照，分别将转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin 2与正常对照组做比较，得倍数为 N(N=2-ΔΔCt)，其中 ΔΔCt= ΔCt(重组质粒)-ΔCt(正常对照)。

1.5 统计学处理 数据用x±s表示，采用SPSS19.0统计软件包处理数据，各组之间的差异采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR标准曲线制作及Ct值测定 实时荧光定量PCR扩增目的基因和内参基因cDNA片段，荧光量的增长曲线符合标准的“S”形荧光增长曲线，3个复孔实时荧光值曲线拟合良好，指数增长期的起始点即循环阈值(Cycle threshold，Ct)接近，阴性对照Ct值趋于0;熔解曲线集中，峰值高尖平滑，表明实验反应体系稳定，模板分配均匀，引物无二聚体形成，结果可靠。以不同起始浓度模板(分别为101、102、103、104、105)制作标准曲线，线性关系大于98%，扩增效率均大于95%，可以用2-ΔΔCt法对比Survivin和PTTG mRNA在不同组的表达差异。

2.2 Survivin和PTTG mRNA在不同组的表达 Lovo细胞转染重组质粒pGenesil-2-对照、pGenesil-2-Survivin 1和pGenesil-2-Survivin2后，Survivin mRNA表达情况见表1，PTTG mRNA表达情况见表2。Survivin基因沉默后24～72 h，与正常对照组相比，Survivin mRNA表达明显降低(P＜0.05)，表明干扰效果可以满足实验需要。Survivin基因沉默后24～72 h后，PTTG mRNA表达较相同时间点正常对照组均呈现下调趋势，其中，24和48 h后，pGenesil-2-Survivin 1组和 pGenesil-2-Survivin 2组PTTG mRNA表达显著低于正常对照组(P＜0.05)。

表1 各组转染后不同时间Survivin mRNA表达情况(x ± s，n=6)

表2 各组转染后不同时间PTTG mRNA表达情况(x ± s，n=6)

3 讨论

Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员，是有丝分裂及程序性细胞死亡关键调节因子，其功能不仅局限于抑制细胞凋亡，而且能够调节有丝分裂的纺锤体关卡，参与肿瘤血管形成及肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。Survivin主要表达于黏膜层腺体底部，结肠癌组织及细胞株中显著增高，而且与肿瘤分化程度明显相关，是结直肠癌发生的早期事件〔6〕。邢洪存等〔7〕检测58例结直肠癌组织及其邻近的正常组织中Survivin基因mRNA的表达，发现Survivin基因mRNA在结直肠癌组织中表达明显增高，并与病理分期、淋巴结转移等临床病理特征密切相关。PTTG是一种新型原癌基因，该基因位于人类第5号染色体长臂3区3带(5q33)，含有5个外显子和4个内含子，作用是通过抑制分裂酶的活性抑制成熟前的染色体分裂，参与生命的多个关键进程，如细胞有丝分裂、细胞周期的进行、细胞凋亡及DNA修复等。Heaney等〔8〕运用RT-PCR方法检测了48例结肠癌和20例结肠息肉患者中PTTG mRNA表达，发现结肠癌和结肠息肉中PTTG mRNA的平均含量都是正常结肠黏膜的2.2倍。由于Survivin和PTTG mRNA在结直肠癌中表达均明显增高，并且有望作为潜在的结直肠癌治疗靶点，提示两者可能存在一定的关联性，相互促进共同参与结直肠癌的发病。

本研究表明Survivin可能与PTTG相互联系参与结直肠癌的发生发展。然而，Survivin与PTTG相互关联的网络效应仍需要进一步实验证实。相信随着研究的不断深入，Survivin与PTTG将会在结直肠癌的基因治疗中展示出更大的价值。

1 Okon K，Demczuk S，Klimkowska A，et al.Correlation of microsatellite status，proliferation，apoptotic and selected immunohistochemical markers in colorectal carcinoma studied with tissue microarray〔J〕.Pol J Pathol，2006;57(2):105-11.

2 Abd El-Hameed A.Survivin expression in colorectal adenocarcinoma using tissue microarray〔J〕.J Egypt Natl Canc Inst，2005;17(1):42-50.

3 史美龙.Survivin特异性shRNA表达载体的构建及评价〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(11):1352-3.

4 史美龙.Survivin基因小干扰RNA对人结肠癌细胞生物学行为的影响〔J〕.中国老年学杂志，2009;29(14):1733-5.

5 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method〔J〕.Methods，2001;25(4):402-8.

6 Kalliakmanis JG，Kouvidou C，Latoufis C，et al.Survivin expression in colorectal carcinomas:correlations with clinicopathological parameters and survival〔J〕.Dig Dis Sci，2010;55(10):2958-64.

7 邢洪存，郭芳芳，卢振霞.Survivin在结直肠癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.中国医药指南，2010;28(8):24-6.

8 Heaney AP，Singson R，McCabe CJ，et al.Expression of pituitary-tumour transforming gene in colorectal tumours〔J〕.Lancet，2000;355(9205):716-9.