反义miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒载体对膀胱癌细胞生长的抑制作用

温都苏 刘禄成 魏 巍 李 志 郭 航 张 明

(吉林大学第二医院泌尿外科，吉林 长春 130041)

癌基因与抑癌基因的平衡紊乱在肿瘤的生长和转移中扮演着重要角色〔1，2〕。微小 RNA-21(miRNA-21)是目前公认的癌基因〔3，4〕，肿瘤抑素(Tumstatin)则是被广泛认同的抑癌基因〔5〕。已有研究证实，前者在膀胱癌病人的肿瘤组织中表达上调，后者则表达不足。由此推测，这两种基因的平衡失调在膀胱癌的发生发展中可能起着至关重要的作用。本研究应用反义miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒载体，通过经尿道膀胱灌注的方法治疗，观察该载体对裸鼠膀胱原位移植癌生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 反义miRNA-21/rAV-Tumstatin腺病毒载体由本实验室构建〔6，7〕。人膀胱癌T24细胞株购自中国科学院上海细胞所。二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)比色仪为美国Sigma公司产品。原位末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自北京中山生物公司。BALB/C裸鼠购于中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠膀胱癌模型的建立和疗效评估及肿瘤标本的处理按照参考文献〔6〕所述方法建立模型。选取20只瘤体大小几乎相同的成瘤裸鼠，随机分为四组，每组5只，分别每隔5 d经尿道膀胱灌注1次载体(反义miRNA-21、rAV-Tumstatin、联合应用组)和生理盐水(对照组)，每组均灌注4次，28 d为1个疗程。每隔7 d(灌注后的第2天)用ESDREF1.5T核磁扫描仪检测肿瘤大小，计算肿瘤体积。在实验结束后的第2天处死所有裸鼠，迅速切开膀胱，完整剥取瘤体称重，并用游标卡尺检测肿瘤的长径和短径，以长(mm)×宽(mm)表示肿瘤的大小，然后切片，10%甲醛固定，石蜡包埋备用。

1.2.2 MTT法检测肿瘤细胞的增殖 5μm厚的组织切片脱蜡、脱水后经蛋白酶 K 37℃消化30 min，双氧水封闭，滴加MMT显色液，37℃湿盒孵育1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，37℃湿盒孵育30min，苏木素复染。用PBS代替MTT显色液作为阴性对照，阳性对照切片经DNA酶Ⅱ预处理10 min后按MTT法步骤进行染色，实验重复3次。阳性结果判定:增殖细胞的胞质呈黄褐色。每张切片观察5个视野，每个视野计数200个细胞，增殖细胞所占的百分率即为瘤细胞的增殖率。

1.2.3 TUNEL法检测肿瘤细胞的凋亡 仍用1.2.2的处理标本，不同的是，把滴加的MTT显色液换为TUNEL反应液进行孵育，以PBS代替TUNEL作为阴性对照。阳性对照切片经DNA酶Ⅰ处理后按TUNEL法染色步骤。结果判定:凋亡细胞的胞核呈棕黄色，凋亡细胞在计数的200个细胞中所占的百分率即为凋亡率。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行分析，资料数据以x±s表示，均数间比较用t检验。

2 结果

2.1 反义miRNA-21/rAV-Tumstatin双靶向治疗对移植瘤生长的影响 反义miRNA-21组，rAV-Tumstatin组和联合应用组的肿瘤体积分别从第14、21、28天开始逐渐变小，三个治疗组间比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)，其中联合应用组的抑瘤效果最为显著，从第28天起该组裸鼠的肿瘤体积明显小于rAV-Tumstatin组(P＜0.05)。实验结束后测得各组的肿瘤大小依次是:反义 miRNA-21组(37.50±9.21)mm2，rAV-Tumstatin组(28.64±5.13)mm2，联合用药组(13.78±6.25)mm2，对照组(69.75±8.43)mm2。单一治疗组与对照组比较虽差异具有统计学意义(P＜0.05)，但联合用药组和对照组比较差异更明显(P＜0.01)。

2.2 反义miRNA-21/rAV-Tumstatin双靶向治疗对移植瘤组织中肿瘤细胞增殖的影响 反义miRNA-21组，rAV-Tumstatin组，联合应用组和对照组的细胞增殖率分别为48.7%±6.2%，35.8% ±9.4%，27.8% ±3.7%和92.8% ±7.4%。与对照组比较，各治疗组细胞均出现了不同程度的生长抑制现象(均P＜0.01)，其中联合应用组的生长抑制最为明显，与rAV-Tumstatin组比较，差异仍具有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

2.3 反义miRNA-21/rAV-Tumstatin双靶向治疗对移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的影响 TUNEL法检测结果显示，反义miRNA-21组，rAV-Tumstatin组，联合应用组和对照组肿瘤细胞的凋亡率分别为51.2% ±7.5%，57.8% ±6.9%，79.3% ±4.1%和8.3%±2.6%。三个治疗组的凋亡率均比对照组明显增加(均P＜0.01)，其中联合应用组细胞的凋亡率最高，与单一治疗的两组比较，差异仍具有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图1 裸鼠移植瘤细胞增殖分析(MTT，×200)

图2 裸鼠移植瘤细胞凋亡分析(TUNEL，×200)

3 讨论

新近研究认为，肿瘤是一个多因素和多基因共同参与的复杂疾病。由于联合基因靶向治疗肿瘤可针对不同的基因极大地提高肿瘤相关基因的治疗效果，同时降低对其他正常组织器官的毒副作用，故成为目前肿瘤治疗研究的热点〔8，9〕。本实验中，针对癌基因miRNA-21和抑癌基因Tumstatin分别构建了反义miRNA-21和rAV-Tumstatin腺病毒载体，结果发现二者单独或联合应用时，对裸鼠原位膀胱癌移植模型及癌细胞虽然均具有抑制增殖并诱导其凋亡的作用，但是联合应用时作用更大，效果更佳。这一结果提示:靶向miRNA-21和Tumstatin均可分别抑制膀胱癌细胞的生长，但靶向双位点由于在抑制癌基因表达的同时上调了抑癌基因水平，从两个截然不同的层面双重作用，具有更好的正性相加功效，从而使其抑制肿瘤的作用发挥到最大程度。本实验结果为临床膀胱癌的多位点基因治疗提供了实验依据，亦为今后的临床试验奠定了理论基础，其临床实际应用前景与潜力值得进一步深入研究。

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