疲劳应激对血管内皮功能障碍大鼠脂蛋白相关磷脂酶A2含量和4型G蛋白耦联受体表达的影响及通络干预的作用

韩建科 魏 聪 贾振华 常丽萍 王宏涛 张彦芬

(河北以岭医药研究院，河北 石家庄 050035)

长期的过度疲劳得不到有效缓解会对人体多个系统造成损害，尤其对血管系统的危害更大，可引起血管内皮损伤，导致动脉粥样硬化及冠脉狭窄，引发严重的心血管事件。研究表明，脂蛋白相关磷脂酶A2(lp-PLA2)水解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)磷脂成分生成的溶血性磷脂酰胆碱(LPC)是导致血管内皮功能障碍的重要因子〔1〕。LPC发挥损伤内皮细胞的作用也需要特异性受体作用，其中包括最新发现的4型G蛋白耦联受体(GPR4)。最近研究表明，LPC通过内源性GPR4介导内皮细胞功能障碍性异常。既往研究发现过度疲劳可导致血管内皮损伤，而对过度疲劳模型大鼠Lp-PLA2激活损伤血管内皮机制未见报道。本实验将研究过度疲劳致血管内皮功能障碍大鼠血清lp-PLA2和GPR4的表达变化及通络干预的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雄性 Wistar大鼠60只，体重220～250 g，由北京维通利华动物中心提供〔许可证号:SCXK(京):2006-2009〕。大鼠笼养，5只/笼，饲养于国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)实验中心，光照12 h/d，温度20℃ ～23℃，相对湿度40% ～60%。

1.2 药物 人参总皂苷(批号:20090116)和通心络超微粉(批号:20090228):石家庄以岭药业股份有限公司提供。人参用量:生药1.2 g·kg-1·d-1(1 mg干粉约为0.117 g生药)，通心络用量:1 g干粉约为1.46 g生粉(生药1.2 g·kg-1·d-1)。

1.3 试剂 内皮素(ET)放射免疫试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司，批号:20091025);一氧化氮(NO)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:20091106);lp-PLA2试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司，批号:E02L0205);GPR4多克隆抗体(美国Abcam公司，批号:ab75330)。ECL化学发光试剂盒、蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)。RNA提取试剂Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆转录酶(M-MLV)，核糖核酸酶抑制剂(RNasin)，dNTP，Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)，随机引物(Random primers)，琼脂糖(agarose)均为美国Promega公司产品;β-actin(Santa Cruz公司)。

1.4 仪器设备 大鼠泳缸〔国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)实验中心制作〕;S-3500型扫描电镜(日本日立公司);ABI 7300 Real-Time PCR System(美国 ABI公司);UVP凝胶扫描系统(美国UVP公司);电转膜仪、半干转膜仪、垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司);酶标仪(美国Thermo公司)。

1.5 方法

1.5.1 分组及给药 将大鼠随机分为:①对照组。②疲劳应激组:参照文献〔2〕并进行改良，以“基础饮食+负重力竭游泳法”建立过度疲劳动物模型，造模大鼠于基础饮食(每只成年大鼠于静息状态下的进食量，约相当于自身体重的5%)状态下在25℃ ～27℃水温的自制泳缸(60 cm×40 cm×100 cm)中，每日强迫负重(尾部悬挂自身体重5%的重物)游泳两次，前后相差10 min，每次游泳至力竭为止，如见大鼠游泳范围逐渐缩小，动作明显失调，头部没入水面下10 s不能上浮则终止游泳。连续力竭游泳14 d至模型建立。③人参组(生药1.2 g·kg-1·d-1);④通心络组(生药1.2 g·kg-1·d-1)。

1.5.2 标本采集与指标检测

1.5.2.1 过度疲劳模型评价 实验末测体重。爬杆时间:于末次给药后，将单只大鼠放在悬杆架的玻璃棒上，使其肌肉处于静力紧张状态，记录大鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒跌落的时间，第三次跌落时终止实验，累计计量三次跌落时间为爬杆时间。最后一次力竭游泳时间。

1.5.2.2 血液指标 10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔麻醉大鼠后，腹主动脉采血，一份注入含有10%乙二胺四乙酸(EDTA)二钠 30μl和抑肽酶 40μl的试管中，混匀，4℃，3 000 r/min，离心10 min;另留二份常规分离血清后，-20℃保存。采用放射免疫分析法检测ET，硝酸还原酶法检测NO，酶联免疫吸附方法检测lp-PLA2，实验操作严格按照说明书进行。

1.5.2.3 扫描电镜观察 造模结束后10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仔细分离并截取约1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm大小主动脉标本迅速投入2.5%戊二醛中4℃固定，PBS充分清洗后，用1%锇酸4℃固定再用PBS充分清洗，酒精梯度脱水，临界点干燥器对样品进行干燥，真空镀膜仪对样品进行金属镀膜，扫描电镜观察并摄片。

1.5.3 Real Time PCR法检测GPR4 mRNA表达 取约100 mg血管组织，Trizol一步法提取组织总RNA，42℃反转录50 min合成第一链cDNA，采用染料法(Syber Green I)进行实时荧光定量PCR检测。扩增完毕后，进入SDSv1.3软件结果分析界面，以GAPDH为内参照基因，与对照组相比，得到各组目的基因表达的定量值(RQ值)，将RQ值用于统计分析。GPR4(115 bp)所用引物序列:上游5'-CGGGTCAAGACAGCAGTAG-3'，下游5'-AGAAGGTGTGGTTGTAGCGAT-3'。

1.5.4 Western印迹法检测GPR4蛋白表达 各组实验结束后留取主动脉组织，用PBS洗去组织表面残留血液，取100 mg主动脉组织标本，加入组织裂解液下匀浆，4℃离心分离上清，采用改良酚试剂法进行蛋白定量。取各组蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜后封闭，经一抗结合后洗膜，二抗结合，洗膜后采用增强型ECL化学发光法显色。凝胶成像系统照相，实验结果采用quantity one软件分析，扫描光密度(OD)值，蛋白相对表达量以目的蛋白与内参β-actin的比值表示。

1.6 统计学处理 数据用x±s表示。采用SPSS13.0统计软件包，多个样本均数比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多个样本均数间的两两比较用最小显著差法(LSD)，若方差不齐则采用Satterthwaite-t检验行两两比较。

2 结果

2.1 各组大鼠体重、爬杆时间、游泳时间变化 与对照组比较，实验末疲劳应激组大鼠体重和爬杆时间均显著下降(均P＜0.01);与模型组比较，人参和通心络干预对体重无明显影响，但均可以明显延长大鼠爬杆时间(P＜0.05，P＜0.01);比较各组最后一次力竭游泳时间，人参和通心络均有延长大鼠力竭游泳时间的作用(P＜0.05)。见表1。

表1 实验末各组大鼠体重、爬杆时间、最后一次力竭游泳时间变化(x ± s，n=15)

2.2 扫描电镜下动脉内皮形态变化 对照组血管内皮表面光滑，内皮细胞连接紧密，排列规整;疲劳应激组内皮细胞界限消失，细胞脱落，表面有红细胞等沉积物;人参组和通心络组内皮细胞表面光滑，界限清晰，连接较紧密，无剥脱损伤。见图1。

2.3 各组大鼠血液NO、ET、lp-PLA2水平 与对照组比较，疲劳应激组大鼠血清NO水平明显降低(P＜0.05)，血浆ET水平显著升高(P＜0.01)，血清lp-PLA2水平显著升高(P＜0.01);与疲劳应激组比较，人参组、通心络组大鼠血清NO水平均显著升高(均P＜0.05)，血浆ET水平显著降低(P＜0.05，P＜0.01);血清lp-PLA2水平显著降低(均P＜0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血液ET、NO、lp-PLA2水平(x ± s，n=15)

2.4 RT-PCR检测GPR4 mRNA表达 疲劳应激组大鼠血管组织GPR4 mRNA表达(4.34±0.52)较正常组(0.81±0.18)显著上调(P＜0.01)。而人参和通心络均能够明显下调GPR4 mRNA的表达(2.32±0.32，1.49±0.30)，且均有统计学差异(P ＜0.01)。

2.5 Western印迹检测GPR4蛋白表达 与对照组比较，疲劳应激组GPR4蛋白表达显著上调;与过劳组比较，人参和通心络干预组GPR4蛋白表达均明显下调，且通心络下调更加明显。见图2。

图1 各组大鼠主动脉内皮细胞扫描电镜(×1 500)

图2 各组主动脉GPR4蛋白表达变化

3 讨论

由于近些年来“过劳死”现象日趋增多，而且有向年轻化发展的趋势，对于过劳等社会心理因素在心脑血管疾病发生中的作用应引起重视。既往研究发现，负重力竭游泳可导致血管内皮形态和结构变化及功能障碍，如内皮细胞肿胀、炎细胞浸、内皮分泌NO减少、ET增加〔3〕。长期过度疲劳导致的慢性应激促使体内自由基产生增多，氧化应激是内皮损伤过程中的重要因素。病理情况下，超氧阴离子等自由基促使过多的LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL与内皮功能障碍关系密切，是血管损伤过程中的重要起始因子〔4〕。

研究证明，lp-PLA2水解ox-LDL上的氧化卵磷脂产生LPC和氧化的非酯化游离脂肪酸等促炎物质起到促动脉硬化作用〔5〕，LPC在lp-PLA2影响内皮功能障碍中发挥重要作用，lp-PLA2在早期冠状动脉粥样硬化病变中的作用主要通过LPC产生〔1〕。LPC可以通过与细胞膜上的特定受体相互作用发挥生物学效应，如孤儿G蛋白耦联受体(G2A)、GPR4等，其中GPR4受体分布广泛，在血管内皮细胞中有一定表达〔6〕。最近研究表明，LPC通过内源性GPR4受体介导内皮细胞障碍性功能异常，通过RNA干扰GPR4受体，可以部分抑制LPC诱导的应力纤维形成、RhoA激酶激活以及内皮细胞的通透性，GPR4受体可能在LPC触发的炎症反应中具有重要作用〔7〕。

研究证明通心络可以消除自由基损伤，起到抗氧化、改善内皮功能的作用。人参作为通心络拆方研究的代表药，针对络气虚滞具有益气通络的作用。研究显示，人参对高同型半胱氨酸血症所致的内皮损伤有防治作用，可以改善内皮依赖性血管舒张功能。人参还具有抗中枢疲劳，抗自由基，调节糖代谢等抗疲劳作用〔8〕。本研究对过度疲劳引起的血管内皮损伤大鼠血清lp-PLA2和主动脉GPR4受体表达进行检测，发现过度疲劳模型大鼠血清lp-PLA2水平增加，主动脉GPR4 mRNA和蛋白表达均显著增加。通络干预对血清lp-PLA2水平和主动脉GPR4表达均有显著抑制作用。这可能是通络方药阻止和减缓血管内皮损伤的重要机制之一。因此，对于心脑血管疾病的防治，除倡导科学的工作与生活态度、健康的生活方式外，对于已经因过劳等不良社会心理因素诱发血管内皮功能损伤者，通络治疗是防治此类疾病发生发展的重要手段之一。

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