稳定转染细胞外基质磷酸糖蛋白细胞株构建及附着力改变研究

刘 爽,魏 巍,张 辉,侯 杰,张淑红,罗 兰,范晓艳

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

肿瘤的侵袭性与转移性是肿瘤恶性生物学行为,也是肿瘤难以彻底治愈的主要原因,随着原发性恶性肿瘤治疗疗效的提高,生存期的延长,转移性肿瘤在临床上出现的频率也在增加。因此国内外研究人员对于肿瘤细胞转移机制的研究一直是研究热点。细胞外基质磷酸糖蛋白(Matrix Endocellular Phosphoglycoprot Ein,MEPE)是 2000年 Rowe PS等人最早在肿瘤源性骨软化症(tumor induced osteomalacia,TIO)的肿瘤中分离得到的,其定位于人的第4号染色体(4q21.1),认为是一种肿瘤细胞分泌的磷酸化蛋白因子[1]。通常作为细胞基质蛋白与细胞的运动、附着及迁移能力密切相关,本实验探讨 MEPE蛋白对细胞附着能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株及载体

细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒与 CHK1 cDNA质粒,均由美国 EMORY大学王亚教授馈赠。M RC5细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为 BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌 E.coli DH5α由本室保存。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化采用 BIO101公司提供的 Geneclean II试剂盒(Cat#1001-400);质粒提取采用 Qiagen公司 QIAprep质粒提取试剂盒;Chk1抗体购自 Santa Cruz生物技术公司;ECL显色系统购自 Amersham Biosciences公司;限制性内切酶及 T4DN A连接酶购自 Takara生物公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔抗体购自中山生物技术公司。

1.3 仪器

PCR仪、UV-160紫外分析仪、半干转膜系统、凝胶成像系统使用均在佳木斯大学生命科学实验中心完成。

1.4 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定

由质粒上扩增出 MEPE cDN A全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′下游引物:3′-GGATCCTTACATT TGGGGGAGATG-3′PCR扩增的目的基因经 Nde I与 BamH I双酶切后,克隆到经过同样酶切处理的 pLEGFP-N1载体上,得到融合表达质粒,转化感受态大肠杆菌 DH5 α,用含氨苄霉素的 LB培养板培养过夜 ,挑取单克隆进行 PCR筛选,选1～ 2个阳性克隆进行测序,鉴定序列及读码框架是否正确。

1.5 Western blotting检测

收集稳定转染细胞,RIPA裂解,12% SDS-PAGE蛋白电泳,电泳结束后用半干转移系统将蛋白转印至 PV DF膜上,5%脱脂牛奶封闭过夜,1:500加入 M EPE或 CHK1抗体(鼠单抗)作为一抗,37°C温育2h,TBST洗涤三遍,1:1000加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体作为二抗,37°C温育1h,TBST洗涤三遍,用 ECL显色系统使 X光片感光,获得显色条带。

1.6 附着力检测

采用含10%小牛血清的 DMEM培养基在37℃,5%CO2,饱和湿度的细胞孵箱中进行培养细胞达到指数生长期,0.25%胰蛋白酶消化成单个细胞,铺96孔板,1h后吸弃上清,PBS清洗2次,台盼蓝染色后立即计数。

2 结果

稳定转染细胞株中相应的外源基因呈现高表达(见图1)。转染 M EPE与 MEPE/CHK1的细胞株附着力明显增加(见图 2)。

图1 稳定表达 M EPE-HA与 CHK1的细胞株 Western印迹鉴定结果

图2 各细胞株附着力检测结果

3 讨论

细胞外基质磷酸糖蛋白属于 SIBLINGs家族成员。在正常生理情况下与成骨细胞、破骨细胞功能密切相关,因为SIBLINGs家族成员都含有 RGD序列,可以与细胞表面受体蛋白结合参与细胞增殖信号传导通路,导致生物力学改变,与细胞迁移能力有密切关系。近几年来,越来越多的报道显示 SIBLINGs家族成员与肿瘤发展的各个阶段包括增殖、侵袭、转移、血管生成都相关[2,3]。本实验组早期致力于研究细胞外基质磷酸糖蛋白与细胞抗辐射性关系,发现其在辐射耐受细胞中高表达。在本实验中我们发现在细胞株中 M EPE蛋白表达量增高会提高细胞附着能力,并且与细胞周期检查点蛋白 CHK1有相辅相成的作用,提示我们 M EPE蛋白与肿瘤细胞的转移相关。

[1] Rowe PS,Zoysa PA,Dong R,et al.M EPE,a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

[2] Bellahcene A,Castronovo V,Ogbureke KE,et al.Small integrinbinding N-linked Glycoproteins(SIBILIN Gs):multifunctional protein in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,8(3):212-226

[3] Fisher LW,Fedarko NS.Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLING family of proteins[J].Connect Tissue Res,2009,44(Suppl1):33-40