M TA-2 mRNA在喉鳞癌及癌旁不同距离组织中的表达研究

霍海峰,范宗宪,牟嘉砾,栾毕奇,勾 晶,白 洁

(佳木斯大学附属第一医院耳鼻喉科,黑龙江 佳木斯 154003)

喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤,外科手术切除是治疗喉癌的主要措施,自奥地利医师 Billroth第一例全喉切除术成功问世,经历一百多年的发展,方法不断的改进,手术模式既要彻底切除肿瘤,又要保留正常喉黏膜组织,重建呼吸、饮食和发音功能,所以手术安全切缘定位成为临床治疗成功与否的重要指南。目前,临床把喉癌旁5mm作为手术的安全切缘仍留有争议。我们采用应用逆转录聚合酶链反应方法,对喉鳞癌和癌旁不同切缘组织中的 M TA-2mRN A表达情况,从分子水平的角度探讨手术安全切缘,为临床喉癌手术的定界提供有价值的理论客观依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本与病人资料

我们收集自 2010-01～ 2011-01佳木斯大学附属第一临床医院耳鼻咽喉-头颈外科30例住院患者首次手术切除的新鲜喉鳞癌及癌旁喉组织,分别取材于癌中心和距离癌缘2mm、5mm、10mm的组织,并以标记。30例患者均未曾接受过放、化疗,且病理报告为鳞状细胞癌。男 27例,女3例;中位年龄 58岁。按照 International Union Against Cancer(UICC)于2002年修订的肿瘤 pTNM分期标准:Ⅰ 期22例,Ⅱ期8例,喉鳞癌中高分化10例,中分化13例 ,低分化7例,全部患者临床资料完整,均无颈部淋巴结转移。

1.2 RT-PCR检测方法

采用 Trizol试剂(Invitrogen公司 )提取组织总 RNA,利用 RN A PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒 (TaKaRa公司)进行 RT- PCR。MTA - 2引 物 序 列: 5-TGTACCGGGTGGGAGATTAC - 3, 5 -TGAGGCTACTAGAAATGTCCCTG-3,产物长度153bp,复 性 温 度 53℃。β - actin 引 物 序 列: 5-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3, 5 -AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3,产物长度 308bp,复性温度55℃。RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,BioImaging System采集图像并分析 ,以β-actin为内参照。

1.3 统计学分析

应用 SPSS for Windows 13.0软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差± s)来表示,采用 t检验。P ＜ 0.05被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 喉癌及癌旁不同距离组织中 M TA-2的 mRN A表达

喉癌组织中 M TA-2的 mRNA表达明显高于癌旁组织,而不同距离癌旁组织中 M TA-2的 mRNA表达也有差异。见图1:A,B,C,D分别表示癌旁10mm,5mm,2mm及喉癌组织中 MT A-2的 mRNA表达情况。β-actin为内参照。

2.2 喉癌及癌旁不同距离组织中 M TA-2mRNA表达的统计分析

喉癌组织中 M TA-2 mRN A的平均灰度值为0.96±0.12,癌旁2mm组织的灰度值为0.74± 0.09,明显低于喉癌组织中的表达 (P＜0.05);癌旁5mm组织中 M TA-2的灰度值为 0.43±0.06,也明显低于癌旁2mm组织中的表达 (P ＜0.05),而癌旁10mm组织中 M TA-2的灰度值为0.39±0.08,与癌旁 5mm组织没有显著差异 (P＞ 0.05)。

图1 M TA-2在喉鳞癌组织及癌旁组织中 mRN A的表达

3 讨论

M TA- 2基因 是 属于 metastasis- associated gene(M TAs)家族成员之一,是1998年 Zhang Y等[1]首先发现的。M TA-2是一个分子量为70kDa,编码668个氨基酸残基的蛋白质,人 M TA-2基因位于染色体 11q1213.1。目前认为M TA-2参与组成具有核小体重塑活性的组蛋白脱乙酰基酶 (nucleosome remodeling deac-etylase,NuRD)的 亚基 ,并与生物个体的发育密切相关。此外,文献报道 M TA-2可以通过调节细胞骨架、细胞凋亡和雌激素通路等途径而促进肿瘤的侵袭转移[2～4]。更为重要的是,M T A-2的表达在肿瘤和肿瘤来源的正常上皮组织之间存在差异,并且 M TA-2的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移和组织分化程度密切相关。我国自1975年山东医科大附属医院开展次全喉切除术以来,随着分子生物学的不断深入研究及外科修复技术的不断完善,各类功能性喉部分切除术已应用于临床实践中,其目的是即根治肿瘤保证患者的生存率,又保留喉正常功能,提高生活质量。喉部功能性手术方式很多种,但最终是根据病变部位根治肿瘤,对喉功能进行最大可能的从建和修复。因此,对手术的安全切缘定位更显得重中之重。目前众多文献提示把癌旁5mm作为保证预后和防止复发的手术安全界限,均是以病理组织形态学检查作为依据。随之有相关报道,以切缘阳性的喉癌手术后复发率为33.3%,阴性的为5.8%。原因可能检测切缘组织中的微转移灶在分子水平上发生了变化但其细胞形态结构可能正常。因此,喉癌的安全切缘的正确判定是非常重要的。

本研究从分子水平检测了癌中心和癌旁不同距离的切缘组织 M TA-2的 mRN A表达水平,发现喉癌组织中的表达明显高于癌旁组织,从癌旁2～ 5mm时 M TA-2的 mRN A表达是逐渐降低的,而癌旁 10～ 5mm相比 M TA-2的mRN A表达没有显著差别,说明癌旁5mm处 M TA-2的表达已处于正常水平。而癌旁小于5mm的组织虽然组织学上可无病理改变但在基因表达上可能异常,具有潜在的危险性。而癌旁5mm以外的区域 M TA-2的表达已处于稳定状态而没有继续下降,因此喉癌手术中切除肿瘤的范围应包括距肿瘤边界5mm处的癌旁组织,这样既可有效地切除肿瘤组织并防止复发,而且也能最大限度地保留患者的喉功能并减少手术带来的后期生活质量的显著降低。

总之,在分子水平的基础上检测 M TA-2mRNA在喉癌及癌旁不同距离切缘组织的表达,来研究喉癌手术的切缘定界范围。希望今后能进一步研究发生于不同解剖部位的喉癌中 M TA-2 mRNA与其浸润性之间的相关性,为喉癌手术的分子定界提供客观而有价值的基础资料。

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