大豆脂肪含量遗传分析及QTL定位研究

姚 丹，王丕武，张 君，刘占柱，关淑艳，刘思言，曲 静

(1吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118;2吉林农业大学农学院，吉林长春130118)

大豆是营养价值很高的作物，大豆籽粒一般含有w为19% ～20%的脂肪，以不饱和脂肪酸为主，约占总脂肪酸总量的80% ～90%，饱和脂肪酸约占6% ～20%［1］.许多学者研究表明，大豆种子脂肪含量性状的遗传都是以加性效应为主的数量性状遗传，受许多数量性状座位(Quantitative trait loci，QTL)和环境因子的共同影响［2］.传统的高油、高蛋白大豆育种主要通过个体表型进行选择，育种效率低，周期长，因此仅采用传统育种途径对这些性状进行选择有很大的难度［3］.分子遗传学的发展和RFLP、RAPD、SSR、AFLP 等分子标记技术的出现，可以通过标记辅助育种来选育与目标性状相关的品种，特别是高密度大豆遗传图谱的构建，将极大地推动育种事业的发展［4］.

1992年Diers等［5］利用 RFLP标记对大豆脂肪定位，报道了9个表型变异解释率均在10%以上的与油分含量有关的QTL，位于连锁群A和K上.Lee等［6］利用2个重组自交系群体和RFLP标记，发现脂肪含量有关的QTL共7个，表型解释率大于10%的有4个，分别位于连锁群R、C1和G上.张忠臣等［7］应用美国品种Charleston与东农594杂交衍生的154个F10RIL群体，共检测到4个油分QTL，其中oil2、oil3、oil4 贡献率为 11.2% ～16.4%;梁慧珍等［8］研究发现控制脂肪含量的11个QTL涉及A1、A2、B2、C2 和 D2等5 条连锁群.葛振宇等［9］在 E、H、I连锁群上定位到3个与脂肪含量有关的QTL，分别可解释21.1%、17.2%和28.0%的表型变异.国内外有关大豆脂肪含量QTL定位的研究很多，但多数都是以1年的数据为基础进行检测的，通过多年的数据进行QTL检测的报道尚少.从统计学上讲，同时分析多年的数据，能增大QTL的检测强度，准确估计QTL的位置和效应.

本研究以高蛋白大豆品种吉育50和高油大豆品种吉农18杂交后获得的F2及其衍生群体为材料，采用主基因+多基因混合遗传模型(Mixed genetic model)和QTL IciMapping v 2.2完备区间作图法(Inclusive Composite Interval Mapping，简称ICIM)研究大豆脂肪含量的遗传规律，并连续3年对大豆脂肪含量进行QTL定位及效应分析，目的是探讨大豆脂肪含量的遗传特性、检测与脂肪含量相关的稳定存在的主效QTL，以期为应用分子标记辅助选择培育高脂肪大豆新品种提供理论参考.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 选取高蛋白大豆品种吉育50为母本(P1)，高油大豆品种吉农18为父本(P2)，于2005年夏季在吉林农业大学生物中心试验田中进行杂交，获得F0种子，种植 F0，收获1株种子产量为450粒的F1单株，2007年5月将单粒种成450个F2单株，亲本3次重复，单株收获后考种;2008年5月将F2收获的236个单株形成F3家系，田间采用随机区组试验设计，3次重复，收获时每个家系随机收取10株，单株脱粒装袋.2009年5月将236个F3:4家系种植于试验田中，随机区组设计，3次重复.

1.1.2 引物 本研究参照2003年Cregan等［10］发表的“大豆公共图谱”挑选引物，初步确定了380对SSR引物.挑选引物的标准为座位分布均匀且基因多样性程度高，并由大豆数据库SoyBase(http:∥soybase.agron.iastate.edu)中查询SSR的引物序列，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 大豆总DNA的提取 2007年在田间F2单株上取等量大豆新鲜叶片，采用SDS法［11］提取大豆基因组 DNA;2008—2009年以 F2:3和 F3∶4家系为材料，在每个家系中随机选择15株材料，取等量大豆新鲜叶片，混合后提取大豆基因组DNA，同时提取其亲本基因组DNA.

1.2.2 PCR扩增及产物电泳检测 PCR反应体系:10 × PCR Buffer 2.5 μL、2.0 ng/μL 模板 DNA、SSR引物 1 μL、dNTPs(10 mmol/L)1 μL、Taq 酶(4 U/μL)0.25 μL、Mg2+(10 mmol/L)2.5 μL，加 ddH2O 至终体积25.0 μL.94℃预变性5 min;94℃变性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸30 s，共37个循环;72℃延伸8 min，4℃保存.扩增产物进行80 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，65 W恒功率电泳90～120 min，用改进的Sanguinetti银染方法［12］进行银染.

1.2.3 大豆脂肪含量的测定 2007—2009年连续3年对大豆脂肪含量进行测定.具体方法:单株或家系混合脱粒后，取50 g样品利用近红外谷物品质分析仪(BUCHI NIRLabN-200)测得.

1.2.4 遗传分析方法 大豆脂肪含量的遗传分析采用盖钧镒等［13］提出的主基因+多基因混合遗传模型中 P1、F1、P2、F2和 F2∶35 个世代联合分离分析法的遗传模型.

1.2.5 连锁图谱的绘制和QTL分析 利用118对在亲本间表现多态性的SSR引物在F2分离群体中进行PCR扩增，对扩增产物进行统计:与父本相同的带型记为“1”，与母本相同的带型记为“2”，杂合带型记为“3”，缺失带型记为“-”.应用软件Mapmaker Exp 3.0进行图谱的构建［14］.利用“Group”命令进行标记间的连锁分析和分组，连锁标记数＜8的使用“Compare”命令进行排序，连锁标记数≥8的使用“Ripple”命令进行排序［15-16］，错误检测水平设为1%，利用Rosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM).

采用QTL IciMapping v 2.2软件，联合3年的分子标记数据和表型数据对F2及其衍生群体的脂肪含量进行完备区间作图，Step=1.0 cM，PIN=0.05，POU=0.1，取LOD=2.5为阈值，对QTL进行定位和效应估算［17］.

2 结果与分析

2.1 大豆脂肪含量的遗传分析

表1列出大豆吉育50(P1)×吉农18(P2)的P1、F1、P2、F2和 F2∶3等 5 个世代的脂肪含量次数分布数据.从表1可知，F1平均表现高于P1亲本平均值，F2表现为2个峰态，可能是2个或多个分布的混合，F2∶3表现为正偏态分布.

同样对于脂肪含量的遗传，也是先比较各个模型的AIC值及极大似然值(表2)，据AIC值最小原则，对于脂肪含量的遗传，AIC值较低的2个模型为C和E-1，其AIC值分别为2 281.84和2 284.36，所以将这2个模型作为备选模型进行分析，进一步对模型进行适合性测验.

表1 大豆吉育50(P1)×吉农18(P2)5个世代的脂肪含量次数分布Tab.1 The frequency distribution tables of fat content in 5 generations of soybean Jiyu50×Jinong18

表2 5个世代脂肪含量在不同遗传模型下的似然函数值和AIC值Tab.2 The likelihood function values and the AIC values of fat content from 5 generations in different genetic model

根据AIC值最小和适合性测验的结果，E-1模型(表3)中有6个统计量达到显著水平，即有6个适合性检验统计量表明E-1模型与分离群体的分布是不一致的;而C模型(表3)中只有3个统计量达到显著水平，即只有3个适合性检验统计量表明C模型与分离群体的分布是不一致的，说明绝大多数都是适合的。因此，研究确定C模型为脂肪含量的最适模型(AIC值最小，适合性检测结果也最好)，为多基因遗传模型，多基因遗传率为79.15%.

表3 脂肪含量遗传模型的适合性检验1)Tab.3 The suitability test of fat content genetic model

1)括号内为相应的概率;*表示在0.05水平差异显著.

2.2 大豆脂肪含量在F2、F2∶3分离群体中的表现

对亲本、F2及其衍生的F2∶3家系分别进行脂肪含量的测定和分析.结果显示，脂肪含量在两亲本间差异较大，在F2及其衍生F2∶3家系中均表现为近正态分布且具有广泛的分布频率，呈现典型的数量遗传模式(图1).w(脂肪)在F2分离群体中的变异幅度为17.36% ～24.19%，其平均值略高于中亲值，偏向父本;在 F2∶3家系中，w(脂肪)的变异幅度为17.31% ～23.34%，平均值略低于中亲值，表现为中亲分离，偏向母本，后代中均有超亲分离现象.

图1 大豆脂肪含量在F2和F2∶3家系中的频率分布Fig.1 Frequency distribution of soybean fat content in F2and F2:3

2.3 大豆脂肪含量QTL定位

先将本研究所选的380对SSR引物在父母本间进行多态性筛选，其中有118对引物在双亲中表现出多态性，多态率为31.05%，再用所得118对SSR引物在F2分离群体的236个单株上进行PCR扩增，经80 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后统计谱带信息.利用Mapmaker Exp 3.0软件，调出数据文件，重组率≤0.50，推测可能的连锁群，以含有2个或2个以上标记的一组为1个连锁群，最终将102个SSR标记划分到25个连锁遗传群中，其中16个SSR标记未被整合进连锁群中，最终构建了一张包含102个标记的大豆SSR连锁遗传图谱.总长度为1 380.3 cM，标记间平均距离为13.53 cM(目前未公开报道).结合3年的分子数据和表型数据，利用QTL Ici-Mapping v 2.2完备区间作图法对大豆脂肪含量进行QTL定位，结果见图2及表4.

图2 完备区间作图法对F2分离群体3年大豆脂肪含量一维扫描(ICIM-ADD)的LOD曲线Fig.2 LOD curve of one dimensional ICIM(ICIM-ADD)for three-year fat content in F2segregating population

以F2代单株为材料，一维扫描(ICIM-ADD)时检测到1个与大豆脂肪含量相关的主效QTL，分布于12(G)连锁群上，可解释31.78%的表型变异，加性效应值为-0.82，表明增加脂肪含量的等位基因来源于父本吉农18.以F2∶3家系为材料分析时，共检测到与大豆脂肪含量相关的2个微效QTL(表4)，分布于17(M)和22(F)2个连锁群上，加性效应值均为-0.21，表现为遗传负效应，即增加大豆脂肪含量的等位基因均来自于父本吉农18.以F3:4家系为材料，仅在12(G)连锁群Sat_287～Sat_342标记区检测到1个表型变异率为37.60%的主效QTL，其加性效应值为-2.02，LOD值为4.64，距离第1个标记Sat_287的距离为13.0 cM，与在F2中检测的qOC-12-1基因座的距离相差不超过5.0 cM，因此，研究初步认为在F2和F3:4家系中检测到的2个QTL为同一稳定QTL，可在今后的大豆高油标记辅助育种中加以应用.

以 F2以及 F2∶3、F3∶4家系为材料，进行二维扫描(互作)分析时，具有明显加性效应的4个QTL在其坐标轴所对应的位置上均未检测到显著上位性互作.

表4 完备区间作图法(ICIM-ADD)检测到的大豆脂肪含量QTLs1)Tab.4 QTLs of soybean fat content detected by ICIM-ADD method

3 讨论与结论

本研究利用盖钧镒等［13］的主基因+多基因混合遗传模型中 P1、F1、P2、F2和 F2∶3等 5 个世代联合分析法分析大豆脂肪含量的遗传方式.结果表明，大豆脂肪含量表现为多基因遗传模型，主要受多基因控制.该结果与徐鹏［18］和王永军［19］报道的结果基本一致，但与郑永战等［20］关于脂肪含量的结果(即大豆脂肪含量受2对加性互补主基因+多基因控制，主基因遗传率为16.23%，多基因遗传率为53.49%)存在一定差异.其原因可能是本研究仅针对2个亲本间进行分析，另外，由于研究中使用的群体是杂交后的早期分离世代F2和F2∶3家系群体，不是稳定的RIL群体，相对于RIL群体本研究中所得遗传参数较少，而且用于统计分析的F2数据不是平均值，导致试验结果受环境影响较大，因此，该结果还有待扩展到更多亲本间的分析和验证.

参照2003年大豆公共遗传图谱，将本研究中定位的大豆脂肪含量QTL与SoyBase库中已定位的大豆脂肪含量QTL进行比较.结果显示，F2∶3家系中位于17(M)上的qPC-17-1基因座与SoyBase库M连锁群中Oil4-7基因座比较，位于相同标记区间，但与第1个引物的距离相差超过5.0 cM，推测在相关区段附近可能存在脂肪含量相关的QTL簇.另外，通过与SoyBase库中相关脂肪含量QTL信息的比较，初步确定了3个新的脂肪含量QTL，即qOC-12-1(F2)、qOC-22-1(F2∶3)和 qOC-12-1(F3:4)，其中 qOC-12-1(F2，F3:4)是1个在2年间稳定存在的主效QTL，可在进一步的高脂肪分子标记辅助育种中加以验证和应用.

数量性状遗传体系的分离分析法和分子标记定位都可以进行数量性状的遗传研究，且二者的分析结果又可以相互印证.本研究中对于脂肪含量的遗传，5 个世代(P1、F1、P2、F2和 F2∶3群体)联合分析结果表明为多基因遗传模型;进行QTL定位分析时，在F2以及F2∶3、F3:4家系群体中共发现LOD值大小相近的2个主效QTL、2个微效QTL.总体来说，模型分析的检测结果与QTL定位的结果大体相近.但是，本研究利用主基因+多基因混合遗传模型分析时，并未检测到脂肪含量的主效QTL，可能是分离分析方法仅可以检测出QTL定位分析中效应值较高的基因，而将其他一部分基因都归入到微效多基因的总概念之中.因此，QTL定位分析中检测的主基因数目通常大于模型分析所检测的主基因数目，这一结果与王贤智等［21］和徐鹏［18］的结果基本一致.将传统遗传模型分析与现代分子标记技术结合起来，必将提高定位的准确性和效率，同时也将极大地减少浪费.

致谢:感谢吉林农业大学生物技术中心的老师和研究生对本研究的支持和帮助!

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