小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定＊

范晶晶

（1.潍坊学院，山东 潍坊 261061；2.山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东 潍坊 261061）

子宫肌瘤的发病率居女性生殖器官良性肿瘤的首位［1］，据卫生部门统计：我国20%～30%成年女性患有子宫肌瘤，每年新发病人数在200万以上［2］。近年研究表明，子宫肌瘤等疾病的病变中主要细胞成份是子宫肌层的平滑肌细胞。小鼠作为实验室常用实验动物，培养其子宫平滑肌细胞作为实验模型，对于研究子宫平滑肌细胞生长、分化、各种致病因素所致子宫病理改变的发病机制和药物治疗的副作用等方面有着重要意义。由于小鼠子宫类型属于长双角子宫［3］，与其它动物相比子宫角直径小取材量少，采用组织块贴壁法培养操作难度大、失败率高，而传统的酶消化法分离培养的效果差。为了提高小鼠子宫平滑肌细胞原代培养的成功率和可行性，我们在参照国内外文献报道［4－9］的基础上，通过对原有的酶消化法进行改良，建立了一种简单、经济、快速、细胞纯度高的新分离培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）实验动物：7～8周龄雌性昆明白小鼠购于中国科学院遗传与发育所实验动物中心。

（2）试剂与仪器：胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、DMEM、F12培养基购于GIBCO公司；青霉素、链霉素购于华北制药有限公司；胎牛血清（FBS）购于杭州四季青生物工程公司；平滑肌肌动蛋白Mouseanti－Actin（英国Novacastra公司），FITC标记的羊抗鼠IgG（GAM－FITC，美国Zymed公司），Hoechst333258（美国MO公司），其它试剂均为国产分析纯。实验设备包括：普通冰箱、CO2培养箱（Sanyo）、解剖显微镜（Motic）、荧光显微镜（Leica）、倒置显微镜（Leica）、超净工作台、高速离心机、恒温水浴箱，恒温台。

1.2 方法

1.2.1 小鼠子宫平滑肌细胞的分离和原代培养

将小鼠麻醉处死，迅速取出子宫放于预冷Hanke’s液（0～4℃）中，冲洗2～3次，以剪刀将周围组织去除干净，将子宫外膜用刀片轻轻刮掉，将子宫纵向剖平铺，内膜面朝上，用镊子固定住一端，从固定处开始用一次性1mL注射器的针头（打弯成30°角）作为分离器轻轻将子宫内膜和基质部分刮掉（分离过程见图1），将内膜和基质去除干净的子宫平滑肌条剪碎至1mm3，用3mL 0.25%的胶原酶和0.25%胰酶混合消化液37℃水浴震荡消化1h，2mL有血清DMEM－F12培养液终止消化，吹打数次，200目细胞筛过滤吸取悬液，再通过400目细胞筛，收集滤液1000rpm／10min离心，基础培养液洗2次，去除细胞碎片，接种于35mm培养皿中培养。台盼兰排斥试验查细胞存活率大于90%［5］。用20%FCSDMEM－F12培养液，放入37℃、95%湿度、5%CO2的培养箱中培养，每隔3天换一次液。

1.2.2 细胞形态学观察

用倒置显微镜观察细胞大小、形态、排列方式及生长特点等。

1.2.3 免疫细胞化学鉴定

贴壁细胞用预冷PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30min，PBS清洗2遍，－20℃预冷甲醇处理20min，用封闭液1%BSA＋0.2%TritonX－100封闭45min。加入平滑肌肌动蛋白（Mouse anti－Actin，1：50）一抗，4℃过夜。次日平衡至室温，加FITC标记的二抗室温孵育2h，用Hoechest33258复染，甘油封片，荧光显微镜观察，暗场下以胞质出现亮绿色为阳性结果，同时计算阳性百分率。

2 结果与分析

2.1 小鼠子宫平滑肌组织的分离与平滑肌细胞原代培养的建立

图1 子宫平滑肌分离过程

取小鼠的子宫，分离出平滑肌，通过光镜，对分离过程进行了观察（见图1）。采用本文所述的注射器针头分离方法可以将子宫平滑肌与内膜基质完全分离，为以后保证细胞培养纯度做好了基础。

采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合消化法消化细胞。体外培养3－4天后形成子宫平滑肌细胞单层，约2周后细胞融合成片。倒置相差显微镜下观察单个平滑肌细胞呈梭形或带状，有多个细胞突起，胞质丰富，胞质密度高，不透明，平行排列成束，部分重叠，表现为典型的“谷”、“峰”状生长（见图2A）。

2.2 子宫平滑肌细胞的免疫细胞化学鉴定

图2 子宫平滑肌培养及鉴定结果

为了进一步鉴定单层细胞中平滑肌细胞的纯度，用平滑肌细胞特异的肌动蛋白（α－Actin）进行免疫荧光染色。染色结果表明：平滑肌细胞肌动蛋白存在于细胞质，绿色荧光为阳性染色，主要分布在胞质区域。为了进一步统计阳性率，免疫染色后用Hoechst333258对细胞进行复染。细胞核在复染后呈现为蓝色，子宫平滑肌细胞呈梭形，胞浆丰富，核大圆形或椭圆形。显微镜下随机选择6个不同的区域（×100），数出单位面积内细胞总数和α－Actin免疫染色阳性细胞数。统计结果表明，细胞单层中平滑肌细胞纯度在98%以上。

3 讨论

子宫平滑肌细胞的收缩、舒张、增殖、纤维化与妇产科疾病密切相关。因此，体外培养子宫平滑肌细胞就成为研究这些疾病及相关药物药理的一种重要实验材料。本研究成功运用自制针头分离器将平滑肌组织与内膜基层完全分离，并使用胶原酶和胰酶混合消化法、采用20%FCSDMEM／F12培养基对小鼠子宫平滑肌细胞进行体外原代培养，所培养的细胞贴壁生长，呈现梭形、成束的平滑肌细胞平行排列，部分细胞重叠生长达多层，部分区域可见典型的“峰一谷”样生长。α－Actin免疫荧光细胞染色阳性，此结果表明所培养的细胞为典型的平滑肌细胞，也说明本方法培养的小鼠子宫平滑肌细胞，虽脱离了原有机体生长环境，仍具有平滑肌细胞的特性。该分离方法简单、快速、成本低、易于掌握、分离纯度高，细胞增殖迅速。

［1］Parazzini F，Chiafarino F，Polverion G，etal.Uterine fibroids risk and history of selected medical conditions linked with femal hormones［J］.Eur J Epidemiol，2004，19（3）：249－253.

［2］张献怀.中国成年女性子宫肌瘤年新发病人数在200万以上［N］.人民日报，2011－07－22（海外版）。

［3］Geeene E C.Anatomy of the rat［M］.New York：Hafner Publishing Co，1959.

［4］Ross R.The smooth muscle cell II.Growth of smooth muscle in culture and formation of elastic fibers［J］.Cell Biol，1971，50（1）：172－186.

［5］Casey M L，MacDonald P C，Mitchell M D，etal.Maintenance and characterization of human myometrial smooth muscle cell in monolayer cuhure［J］.In vitro，1984，20（5）：396－403.

［6］黄柏英，张瑜.人子宫平滑肌细胞体外培养［J］.实用预防医学，2005，12（3）：479－481.

［7］曾润清，刘庚贵，刘惠萍，等［J］.兔子宫平滑肌细胞的原代培养与鉴定实用预防医学，2007，14（2）：267－269.

［8］钱桂生，李淑平.大鼠细小动脉平滑肌细胞分离培养的新方法［J］.中国临床解剖学杂志，2000，18（3）：282－283.

［9］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版西安公司，2004：31.