预消化法酶解饲用海藻粉中非淀粉多糖的初步研究

王昌义 单守水 徐世艾

饲用海藻粉作为一种高营养价值的饲料添加剂，含有丰富的海藻多糖、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质以及具有特殊功效的生理活性物质，其糖类含量在40%以上[1]，特别适合在海参等高附加值水产品的饲料中添加。目前，饲用海藻粉的使用还处于初级阶段，在禽类、畜类以及水产养殖中[2-3]的少量应用均取得了一定的效果。但是，由于海藻细胞中的非淀粉多糖（NSPs）如纤维素、半纤维素、β-葡聚糖、果胶等不能被动物分泌的内源酶降解，产生了食糜黏度增加、营养屏障作用和微生物菌群数量增加等不利影响[4-6]，降低了饲用海藻粉的利用率。解决这一在植物性饲料源使用中普遍存在的问题的方法是在饲料加工过程中添加非淀粉多糖酶[7]来酶解其中的NSPs，经过与动物体内内源酶的协同作用提高饲料养分的消化利用率[8]，但是目前对于海藻粉中NSPs的酶解研究报道较少。为了充分发挥酶制剂对海藻粉的酶解作用，可以用预消化[9]的方法酶解NSPs。章世元等[10-11]对饲料的体外预消化进行了深入的研究，此方法可以避免传统添加法[12]和后置喷涂法[13]中酶制剂活性降低或者不能充分发挥作用的问题。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要材料：饲用海藻粉（鼠尾藻粉），购于莱州市朱旺海参育苗场，80℃条件下烘干备用；纤维素酶(酶比活力 50000 U/g)、木聚糖酶(酶比活力 50000 U/g)、β-葡聚糖酶(酶比活力25000 U/g)、中温淀粉酶(酶比活力3000 U/g)，酶制剂均购于肇东市酶制剂有限公司。

主要仪器：722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司生产；HH-4型数显恒温水浴，江苏省金华市荣华仪器制造有限公司生产；TDL-5-A台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产。

1.2 分析方法

还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）[14]。

1.3 试验方法

1.3.1 酶制剂最佳使用量的确定

配置不同酶活力梯度的纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中温淀粉酶酶液。分别配置10%的海藻粉液20 ml，搅拌均匀后相应加入不同酶活力梯度的纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中温淀粉酶酶液各2.00 ml，混合均匀后于40℃恒温水浴中酶解60 min。酶解完成后经沸水浴灭活、3000 r/min离心、上清液定容后，用3，5-二硝基水杨酸法测定上清液中还原糖含量。确定纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、中温淀粉酶的最佳使用量。

1.3.2 酶制剂最适温度范围的确定

设置温度梯度为 30、40、50、60、70 ℃。按照同样步骤在不同温度条件下以4种酶制剂的最佳使用酶活力进行酶解试验，确定4种酶制剂酶解饲用海藻粉最适温度范围。

1.3.3 酶制剂最适pH值范围的确定

配置 pH 值梯度为 3、4、5、6、7 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液。按同样步骤在不同pH值条件下以4种酶制剂的最佳使用酶活力进行酶解试验，确定4种酶制剂酶解饲用海藻粉最适pH值范围。

1.3.4 酶制剂最适酶解时间条件的确定

设置酶解时间梯度为 30、60、90、120、150 min。按照同样步骤在不同酶解时间条件下以4种酶制剂的最佳使用酶活力进行酶解试验，确定4种酶制剂酶解饲用海藻粉最适酶解时间条件。

1.3.5 4种酶制剂酶解饲用海藻粉的正交试验

为了考查温度、pH值、酶解时间等因素间的相互影响以及综合作用，在确定了4种酶制剂最适酶解温度范围、pH值范围和时间条件后，进行L9(33)正交试验，以确定4种酶制剂最佳使用条件。

1.3.6 3种非淀粉多糖酶的评价试验

在获得了3种非淀粉多糖酶酶解海藻粉中NSPs的最佳使用条件后，为了更好地评价3种非淀粉多糖酶的作用能力，应在其最佳使用条件下同时进行酶解评价试验。通过对比与评价可以确定3种非淀粉多糖酶对海藻粉的酶解能力与酶解效果。

1.3.7 纤维素酶、木聚糖酶与中温淀粉酶的复合试验

海藻粉中的NSPs主要有纤维素、半纤维素、葡聚糖等，其中纤维素和半纤维素主要存在于海藻细胞壁中，而细胞壁的存在阻碍了淀粉酶对细胞壁内淀粉的酶解。为了进一步验证纤维素酶和木聚糖酶对海藻细胞壁中NSPs的酶解情况，应进行纤维素酶、木聚糖酶与中温淀粉酶复合酶解试验，由于β-葡聚糖在细胞壁中量很少，不对其进行复合试验研究。复合酶解试验条件为：每克海藻粉中添加复合的各酶活力均为40U，温度为45℃，pH值为6、酶解时间为60 min。通过复合酶酶解试验与单一酶酶解的对比试验来确定细胞内淀粉是否被利用，从而可以进一步证明纤维素酶和木聚糖酶对海藻细胞壁中NSPs的酶解效果。

2 结果与分析

2.1 4种酶制剂酶解海藻粉单因素试验结果

2.1.1 酶使用量对4种酶制剂酶解效果的影响 (见图1)

图1 酶活力对还原糖增加量的影响

由图1可以看出，每克海藻粉中使用纤维素酶在30 U以上时还原糖的增加量基本不变，说明此时纤维素酶对底物酶解效果达到最佳，结合经济效益考虑应将30 U作为纤维素酶的最佳使用量。同理，每克海藻粉中木聚糖酶最佳使用量为40 U；每克海藻粉中β－葡聚糖酶的最佳使用量为40 U；每克海藻粉中中温淀粉酶的最佳使用量为40 U。由于后3种酶制剂的最佳使用量均为40 U，为了在接下来的试验中增强4种酶制剂的对比，在单因素试验以及正交试验和对比复合试验中每克底物使用4种酶制剂的量均为40 U。

2.1.2 温度条件对4种酶制剂酶解效果的影响(见图2)

图2 温度对还原糖增加量的影响

由图2可以看出，纤维素酶在40～50℃之间时对海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最适酶解温度范围约在35～45℃之间；β－葡聚糖酶最适酶解温度范围约在45～55℃之间；中温淀粉酶的最适酶解温度范围在40～50℃之间。

2.1.3 pH值条件对4种酶制剂酶解效果的影响 (见图3)

图3 pH值对还原糖增加量的影响

由图3可以看出，纤维素酶pH值范围约在4.5～6之间时对海藻粉的酶解效果最好。同理，木聚糖酶的最适酶解pH值范围在5～6之间；β－葡聚糖酶的最适酶解pH值范围在5～6.5之间；中温淀粉酶的最适酶解pH值范围在5.5～6.5之间。

2.1.4 酶解时间条件对4种酶制剂酶解效果的影响(见图4)

图4 酶解时间对还原糖增加量的影响

由图4可以看出，纤维素酶、木聚糖酶、β－葡聚糖酶、中温淀粉酶在酶解时间达到60 min后，还原糖增加量基本不再变化。

2.2 4种酶制剂酶解饲用海藻粉的正交试验结果

通过前面4种酶制剂的单因素试验确定了其最适温度范围、pH值范围、酶解时间条件，为了考查各个因素之间的综合效应，分别用温度、pH值、酶解时间这3个因素对其进行L9(34)正交试验，正交试验的因素水平设计见表1(表中的空白因素略去)。各个因素的水平的选择均在其最适范围内平均划分。

表1 4种酶制剂酶解海藻粉正交试验因素水平设计

4种酶制剂酶解海藻粉的正交试验结果见表2，数据直观分析见表3。

表2 4种酶制剂酶解海藻粉正交试验结果

表3 4种酶制剂酶解海藻粉正交试验数据直观分析

由表2可知，对于纤维素酶，由极差分析可知，pH值极差最大，为0.134，其次为温度，酶解时间影响较小，其最佳组合为B2A1C2，即pH值为5.5、温度为40℃、酶解时间为60 min时酶解效果最好，为其最佳使用条件；对于木聚糖酶，由极差分析可知，pH值极差也是最大，为0.843，其次为温度、酶解时间，其最佳组合为B3A3C1，即pH值为6、温度为45℃、酶解时间为40min时酶解效果最好，为其最佳使用条件；对于β-葡聚糖酶，由极差分析可知，温度极差最大，为0.624，其次为酶解时间和pH值，其最佳组合为A2C2B3，即温度为50℃、酶解时间为60 min、pH值为6时酶解效果最好，为其最佳使用条件；对于中温淀粉酶，由极差分析可知，pH值极差最大，为0.527，其次为酶解时间、温度，其最佳组合为B2C2A1，即pH值为6、酶解时间为60 min、温度为45℃时酶解效果最好，为其最佳使用条件。

2.3 评价试验与复合试验结果(见图5)

评价试验为A、B、C号试验，同时在3种非淀粉多糖酶的最佳使用条件下进行，由图5可以看出，β-葡聚糖酶对海藻粉的酶解能力较好，还原糖增加率达到19.0%，纤维素酶和木聚糖酶的酶解能力相近，还原糖增加率均为10%左右，这一点与海藻细胞壁中纤维素与半纤维素含量相近一致。通过评价试验可以发现：3种非淀粉性多糖酶对饲用海藻粉中的NSPs有一定酶解效果，可使其中的部分NSPs转化为可被动物吸收的营养物质——还原糖。

复合试验为 E、F、G号试验，其中A、B、C、D号试验为其对比。

图5 4种酶制剂酶解海藻粉评价与复合试验结果

由图5可以看出，E试验中还原糖增加量与还原糖增加率分别为1.754 mg/g和29.6%，高于A试验和D试验中还原糖增加量之和1.261 mg/g及还原糖增加率之和21.3%；F试验的还原糖增加量与还原糖增加率分别为1.543 mg/g和26.1%，也高于B试验和D试验中还原糖增加量之和1.310 mg/g及还原糖增加率之和22.1%。在G试验中，还原糖增加量与还原糖增加率分别达到3.013 mg/g和50.9%，较A试验、B试验和D试验中的还原糖增加量之和1.954 mg/g及还原糖增加率之和33.0%分别提高了1.059 mg/g和17.9个百分点。这说明，纤维素酶和木聚糖酶对海藻细胞壁进行了较好的酶解，细胞内的淀粉类物质部分被中温淀粉酶酶解。另外，G试验中还原糖增加量3.013 mg/g与还原糖增加率50.9%既高于B试验和E试验中还原糖增加量之和2.447 mg/g及还原糖增加率之和41.3%，也高于A试验和F试验中还原糖增加量之和2.187 mg/g及还原糖增加率之和37.0%，这表明纤维素酶与木聚糖酶共同使用时效果好于其单独使用。

3 结论

本文以预消化的方法研究了纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等非淀粉多糖酶和中温淀粉酶对饲用海藻粉中NSPs的酶解情况。通过单因素试验与正交试验确定了4种酶制剂酶解的最佳使用条件。通过评价试验发现，3种非淀粉多糖酶在其最佳使用条件下对海藻粉中的NSPs均有较好的酶解效果。通过复合试验证明纤维素酶和木聚糖可以有效地酶解细胞壁中的NSPs，其中纤维素酶、木聚糖酶和中温淀粉酶复合试验比单一酶试验还原糖增加量之和及还原糖增加率之和分别提高了1.059 mg/g和17.9个百分点。

研究表明：非淀粉多糖酶对饲用海藻粉中的NSPs进行了有效酶解，增加了其营养物质含量，可以提高饲用海藻粉利用率。

[1]常巧玲,孙建义.海藻饲料资源及其在水产养殖中的应用研究[J].饲料工业,2006,27(2):62-64.

[2]魏尊,谷子林,赵超,等.海藻粉对蛋鸡生产性能及蛋品质的影响[J].中国饲料,2006(23):37-38.

[3]关荣发,许梓荣.海藻粉在动物营养中的研究应用[J].饲料博览,2002(8):42-43.

[4]孙德文,詹勇,许梓荣.非淀粉多糖的抗营养作用的研究 [J].粮食与饲料工业,2001(11):1-3.

[5]Bedford M R,Classen H L.Reduction of intestinal viscosity through manipulation of dietary rye and pentosanase concentration effected through changes in carbohydrate:composition of the aqueous phase and results in improved growth rates and food conversion efficiency in chicks[J].J.Nutr.,1991,122:560-569.

[6]Hesslman K,Aman R.The effect of β-glucan on the utilization of starch and nitrogen by broiler chickens fed on barley of low or high viscosity[J].Animal Feed Sci.Tech.,1986,45:65-69.

[7]汪勇.非淀粉多糖酶制剂的研究进展[J].饲料工业,2007,28(2):13-16.

[8]Mathlouthi N,Juin H,Larbier M.Effect of xylanase and β-glucanase supplementationofwheatorwheatandbarleybaseddietsontheperformance of male turkey[J].British Poultry Science,2003,44(2):291-298.

[9]章世元,朱沛霁,李海滨,等.加酶饲料体外预消化工艺的可行性研究[J].饲料工业,2002,23(3):17-20.

[10]章世元,张小军,朱沛霁,等.加酶饲料预消化处理工艺研究[J].中国饲料,2002(4):8-9.

[11]章世元,俞路,朱沛霁,等.加酶预消化蛋鸡饲料应用效果的研究[J].动物营养学报,2008,20(6):718-723.

[12]安登第.颗粒饲料酶制剂添加工艺[J].饲料工业,1999,20(6):26-27.

[13]邓君明,张曦,赵素梅.酶制剂的后置添加技术[J].粮食与饲料工业,2002(1):18-20.

[14]王蕾,郑璞.DNS法定量测定海藻糖的研究[J].食品科技,2004(2):82-84.