一年生黑麦草制取燃料酒精发酵工艺的初步研究

代，郭和蓉，张兴龙，李强

（华南农业大学农学院，广东 广州510642）

目前国内外生产燃料酒精的原料主要有玉米（Zeamays）（美国）［1］、甘蔗（Saccharumofficinarum）（巴西）［2］、薯类、谷类等，考虑到粮食短缺、人口压力等问题，寻找一种新的燃料酒精的生产底物势在必行。纤维质原料具有来源广泛、成本低廉、可再生等优点［3］，因此被看作是最具价值的生产燃料酒精的潜在资源，以将纤维素为原料转化为燃料酒精最具现实意义。在纤维素燃料酒精转化的生产和研究方面，巴西和美国走在了世界的前列［4］。巴西开发了以甘蔗渣为原料制酒精的新技术（迪丁尼快速水解法，DHR），减少水解蔗渣的时间而获得高的转化率［5］；美国也进行了“纤维素水解与发酵同步”及木质纤维素“溶解性分离”等一系列研究工作［6］，但以纤维素制乙醇的工业规模技术一直未达到成熟［7］。此外，加拿大Iogen公司在纤维乙醇技术开发，尤其是纤维素酶技术开发方面居世界领先地位［8］；德国产业技术综合研究所进行发酵液中乙醇的膜分离技术的开发；日本也建立了较完善的与纤维素燃料乙醇相关的研发体系［5］。

我国在纤维素酒精生产和技术开发上也取得了一些重要进展。中粮集团在黑龙江肇东建立了年产500t的纤维素乙醇中试装置，并已经拥有36项燃料酒精方面的专利，其中，与纤维素酒精相关的有14项；2008年5月8日，河南天冠集团研制建成了中国首条年产5 000t纤维酒精项目产业化生产线，并且顺利产出了第一批纤维酒精［6］。中国科学院过程工程所已在山东建立了年产3 000t的纤维乙醇示范工程；吉林燃料乙醇有限公司已和华东理工大学就建立年产3 000t纤维乙醇的合作达成协议，并启动了项目实施［8］。除此之外，我国也进行了“利用农业纤维废弃物代替粮食生产酒精”，玉米秸秆间歇蒸汽爆破预处理、纤维素酶水解和戊糖己糖同步发酵技术制取纤维乙醇中试装置等一系列研究工作［6］。

一年生黑麦草（Loliummultiflorum）是禾本科黑麦草属植物，生长速度快，产量高［9］，易种植，好管理［10］，是我国南方广泛栽培的优良牧草［11］。目前，可作为能源植物发展的植物种类丰富，如甘蔗［12］渣、麦（Triticumaestivum）秆［13］、柳枝稷（Panicumvirgatum）［14，15］等。它们的木质素含量［16－18］均比一年生黑麦草高，而它们的纤维素和半纤维素含量［16－18］与一年生黑麦草却有着极大的相似性。另外，一年生黑麦草纤维构成适合于酒精的转化，所以具有较大的研究和开发价值。有研究表明黑麦草已经被应用到发酵等工业领域，将其经过预处理及纤维素、半纤维素酶解后，对探索生物酒精的制备有重要意义［19］。本试验采用2种发酵方案，研究利用一年生黑麦草发酵处理制取酒精，通过对影响因素的优化，得出最佳发酵体系，为再生能源的开发寻找到一条新的途径。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2008－2009年在华南农业大学农学院进行，以分别经过酸预处理［在温度120℃条件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以8∶1液固比经1%H2SO4处理2h］和碱预处理［在温度100℃条件下，粒度18～35目（0.425～0.880mm）的邦德以6∶1液固比经10%NaOH 处理2h］，再用绿色木酶（Trichoderma viride）酶解72h后的一年生黑麦草邦德（L.multiflorumcv.Abundant）为材料。

1.2 发酵单因素试验

经过酶解后的酸碱预处理材料在发酵阶段主要采取2种方案，酵母组合均为普通酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，产品代码CICC1001）＋毕赤酵母（Pichiapastoris）。方案1：预处理材料＋酵母组合，体积比约为7∶3；方案2：预处理材料＋酵母组合＋黑曲霉（Aspergullusniger，产品代码AS 3.877），体积比约为7∶3∶2。所有微生物均由广州微生物所提供。发酵处理的具体方法见表1，试验设3次重复，测定指标为酒精度、原料酒精转化率。

1.3 发酵正交试验

为进一步优化发酵的工艺条件和研究各因素对发酵影响的主次顺序，采用正交试验研究了发酵温度、时间和菌株浓度对预处理的影响，其中酸碱预处理的pH均是5.5，其余各因素水平是在单因素试验基础上选定的，测定指标及试验重复次数同单因素试验，试验条件见表2。

1.4 发酵方法

将酸碱预处理＋酶解后的材料放在250mL三角瓶中进行发酵试验，每瓶装酸（碱）预处理液体（中和后，全部加入）、（NH4）HPO4（0.25g／L）、MgSO4·7H2O（0.025g／L）共100mL。灭菌后置恒温振荡培养箱内振荡培养，控制温度31～43℃。按发酵液体积的8%～14%接种菌株。

表1 酸碱预处理材料酶解后的发酵单因素试验Table 1 Range of factors in fermentation single－factor test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

表2 硫酸（氢氧化钠）预处理材料酶解后的发酵正交试验Table 2 Range of factors in fermentation orthogonal test based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

1.5 测定指标

1.5.1 酒精度 发酵结束后将发酵液置于蒸馏瓶中，缓缓加热蒸馏，收集约96mL馏出液，定容至100mL容量瓶，调温至20℃。用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20℃的相对密度，附温度计比重瓶（整套）先用蒸馏水清洗干净，再用乙醇、乙醚清洗干净，称得自重，计G1；蒸馏水煮沸30min冷却至15℃注满瓶中，装上温度计（注意排空瓶中气体），浸入（20±1）℃的恒温水浴锅中，至比重瓶温度稳定到20～30℃，用滤纸吸去侧管之水，盖上小罩，取出擦干，称得瓶（整套）和水之重，计G3；重复上一步骤测定待测液体，称得瓶（整套）和待测液之重，计G2；酒精相对密度（20℃）计算公式：Y＝（G2－G1）×0.998 23／（G3－G1），根据相对密度查表，得到试样的酒精度（Q）。酒精相对密度见文献［20］。

1.5.2 原料酒精转化率 原料酒精转化率计算公式

式中，y表示原材料酒精转化率（%，w／w），Q表示酒精度（%，V／V），V（mL）是蒸馏液体积，0.8（g／mL）是酒精密度，25.00（g）表示原材料质量。

1.6 数据处理和统计分析

采用SAS 8.1和Excel 2003进行试验数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 发酵温度的影响

2种发酵处理的酒精度随着温度的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图1）。酸预处理＋酶解和碱预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度均在37℃时达到最大值，分别为2.3%，2.5%和2.1%，2.5%。酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度略高于酵母组合处理，差异不显著，说明黑曲霉起到了同步降解纤维素的作用。37℃是比较理想的发酵温度。

2.2 发酵时间的影响

2种发酵处理的酒精度随着发酵时间的延长均呈现出先增加后基本保持不变的趋势（图2）。当发酵时间在36h左右时，酸预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度比较接近，而碱预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度却相差较大，但二者差值却相对恒定，表现为随着发酵时间的延长，绝对差值变幅不大。酸预处理＋酶解和碱预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度分别在36～48和48～60h时达到最大值，分别为2.3%，2.5%和2.1%，2.4%。酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度略高于酵母组合处理，差异不显著。结合发酵数据发现，发酵时间超过48h后，酒精度的增加幅度接近于0或者出现负增长，这可能与微生物自身消耗有一定的关系，综合考虑认为48h是相对最优的发酵时间。

图1 不同发酵温度下的酒精度比较Fig.1 Comparison of the alcohol content at different fermentation temperatures

图2 不同发酵时间下的酒精度比较Fig.2 Comparison of the alcohol content at different fermentation time

2.3 发酵液pH值的影响

2种发酵处理的酒精度随着pH的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图3）。酸预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度范围分别是1.4%～2.3%和1.5%～2.5%，碱预处理＋酶解材料的2种发酵处理的酒精度范围分别是1.4%～2.1%和1.6%～2.5%，且均在pH为5.5时达到最大值，酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度略高于酵母组合处理，差异不显著。

2.4 菌株浓度的影响

2种发酵处理的酒精度随着菌株浓度的升高均呈现出先增加后减少的趋势（图4）。酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度高于酵母组合处理，说明黑曲霉起到了同步降解纤维素的作用。

在不同菌株浓度下，酵母组合处理的酒精度范围分别是1.9%～2.3%和1.7%～2.3%，酵母组合＋黑曲霉处理的酒精度范围分别是2.1%～2.5%和2.1%～2.3%。两种发酵处理的酒精度在菌株浓度分别为10%、12%时达到最大值。

图3 不同pH值下的酒精度比较Fig.3 Comparison of the alcohol content at different pH values

图4 不同菌株浓度下的酒精度比较Fig.4 Comparison of the alcohol content at different concentrations of strains

2.5 发酵正交试验分析

2.5.1 原料酒精转化率变化趋势 2种发酵方案的原料酒精转化率随着温度的升高均表现出先升高后降低的趋势（图5，6），随着发酵时间的延长，原料酒精转化率表现出先有所增加后维持稳定的趋势，当发酵时间超过48 h以后，原料酒精转化率变化幅度不大，时间过长还会导致原料酒精转化率出现负增长。

酸（碱）预处理＋酶解后的材料在发酵阶段，随着菌株浓度的增加呈抛物线形状（图7），即在菌株浓度达到一定程度时，菌株浓度的增加会降低原料酒精转化率，这与微生物自身的消耗有关。随着发酵温度的增加、发酵时间的延长、菌株浓度的增加，原料酒精转化率均呈先增加后降低的趋势。

由图5～7可以得出合适的发酵温度、适中的发酵时间与适宜的菌株浓度均有利于原料酒精转化率的提高，与单因素试验结果一致。

2.5.2 正交试验结果与极差分析 酸预处理＋酶解＋酵母组合的酒精度与原料酒精转化率影响因素主次顺序相同（表3，4），均为菌株浓度＞发酵温度＞发酵时间；酸（碱）预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉和碱预处理＋酶解＋酵母组合3种处理方式的酒精度与原料酒精转化率影响因素主次顺序均相同，均为发酵温度＞菌株浓度＞发酵时间。

酸预处理＋酶解＋酵母组合正交试验的最优水平组合相同，均为D2E2F2，即发酵温度37℃，菌株浓度10%，发酵时间48h；酸预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉正交试验的最优水平组合相同，均为D2E3F1，即温度37℃，菌株浓度14%，发酵时间36h（表4）。整体上对于酸预处理＋酶解的材料而言，2种发酵方案的相对最优发酵温度均为37℃，但相对最优菌株浓度和发酵时间均不一致。结合单因素试验和极差值可以得出，随着菌株浓度的提高，原料酒精转化率的提高幅度不明显，但至于是否会缩短发酵时间还有待于进一步验证。综合考虑认为菌株浓度12%，发酵时间48h是相对最优的选择。

图5 原料酒精转化率随温度提高的变化趋势Fig.5 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the temperature increase

图6 原料酒精转化率随发酵时间延长的变化趋势Fig.6 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the extension of fermentation time

图7 原料酒精转化率随菌株浓度增加的变化趋势Fig.7 The trend of alcohol conversion rate of raw materials with the concentrations of strains increase

表3 酸碱预处理邦德酶解后发酵的正交试验结果Table 3 Results of the fermentation orthogonal design on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis%

表4 酸碱预处理邦德酶解后发酵的正交试验极差分析Table 4 The range analysis method of the fermentation orthogonal experiment on Abundant based on pretreatment with H2SO4（NaOH）and enzymatic hydrolysis

碱预处理＋酶解＋酵母组合正交试验的最优水平组合分别为D2E2F2和D2E2F3，即相对最优发酵温度和菌株浓度均一致，分别为37℃和10%，相对最优发酵时间不一致。碱预处理＋酶解＋酵母组合＋黑曲霉正交试验的最优水平组合分别为D2E2F2和D2E2F3，即相对最优温度和菌株浓度均一致，分别为37℃和12%，相对最优发酵时间不一致。结合单因素试验和极差值可以得出，发酵时间在超过48h后，原料酒精转化率变化幅度不大，时间过长还会导致原料酒精转化率出现负增长。整体上对于碱预处理＋酶解的材料而言，2种发酵方案的相对最优发酵温度均为37℃，相对最优菌株浓度分别为10%和12%，相对最优发酵时间均为48h。

3 讨论与结论

本试验主要针对普通酵母、毕赤酵母、黑曲霉进行了一些探索。通过预处理后，方案1（普通酵母＋毕赤酵母，体积比7∶3）的相对最优发酵条件为：温度37℃，菌株浓度10%，pH 5.5，时间48h。在此条件下，酸碱预处理＋酶解后发酵的酒精度分别为2.2%和2.1%。方案2（普通酵母＋毕赤酵母＋黑曲霉，体积比7∶3∶2）的相对最优发酵条件为：温度37℃，菌株浓度12%，pH 5.5，时间48h。在此条件下，酸碱预处理＋酶解后发酵的酒精度分别为2.3%和2.5%。

酸碱预处理＋酶解后的材料采用发酵方案2的原料酒精转化率相对较高，分别为8.36%和8.39%。2种方案的原料酒精转化率随着发酵温度的增加、发酵时间的延长、菌株浓度的增加，均呈先增加后降低的趋势。综合分析可以得出，2种处理方式的酒精度均为2.2%左右，原料酒精转化率均约8.0%，差异不显著，和安宏［21］的纤维素发酵结果13.6%、李文亮等［22］的甜高粱（Sorghumvulgare）发酵结果14.2%相比，转化率相对较低，说明要在后续研究中深入分析酸碱预处理的特点及预处理后的物质组成，进而为发酵菌种的驯化和选择奠定基础。另外，本试验是在摇瓶条件下进行的，在种子液培养过程中，菌种接入较大，所以实际酒精转化率可能要略小于上述值，离工业应用要求还有很大的差距，还需要进一步的探索研究。

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