浅谈检测肿瘤标志物的方法

郑百波

(长春市人民医院检验科，吉林 长春 130051)

肿瘤是严重危害人们身体健康的一种疾病，大量临床研究表明，对于肿瘤患者及早诊断和治疗是降低病死率的最有效的方法。大多数肿瘤患者早期症状并不明显，而且常规影像诊断、细胞病理学诊断、X线检查等都不能对肿瘤早期做出诊断，因而，这也是导致肿瘤病死率居高不下的主要原因。而目前，随着医学技术的不断提高，肿瘤标志物的检测方法在对肿瘤进行检测中得到了广泛的应用。肿瘤标志物（tumor marker，TM）是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的、或者由机体对肿瘤细胞所产生的反应而生成的，反映肿瘤存在和繁殖的一类物质。肿瘤标志物从发现发展到现在，随着检测手段的不断提高，存在许多检测方法。现将我院2007年6月至2011年6月共收治的107例肿瘤患者应用不同的肿瘤标志物检测方法进行检测的结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2007年6月至2011年6月共收治的107例肿瘤患者，男58例，女49例，年龄在55～78岁之间，平均年龄为66.7岁；其中胃癌患者31例，肺癌患者22例，肝癌患者33例，乳腺癌21例。

1.2 方法

手术治疗或抗肿瘤药物治疗前抽取患者的外周静脉血3mL用于肿瘤标志物检测。检测方法主要采用放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法五种方法。

2 结 果

应用四种不同的检测肿瘤标志物的方法，对肿瘤患者进行检测，结果显示，时间分辨荧光免疫分析法对肿瘤患标志物的检测阳性率最高。除了肺癌检测阳性率为90.91%外，其余均为100%。结果见表1。

3 讨 论

3.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）又称竞争性饱和分析法，是一种超微量分析技术，1960年美国化学家Berson和Yalow在研究胰岛素的抗体时发现的。主要是利用特异抗体与标记抗原的竞争结合反应，通过测定放射性复合物来计算出非标记抗原量的方法。

3.1.1 原理

已知定量的特异性抗体（Ab）与特异性的标记抗原（*Ag），在一定条件下反应形成标记抗原和抗体的复合物（*AgAb）。这抗原与抗体复合物的结合符合可逆反应的规律。如果在反应系统中加入非标记的特异性抗原（Ag），则Ag会与标记抗原（*Ag）竞争性地与特异性抗体（Ab）结合，试验结果表明，反应平衡后，经分析，标记抗原（*Ag）、*Agab或*AgAb与标记抗原（*Ag）的比值和非标记特异性抗原（Ag）的量呈函数关系，由此可以算出AG的含量。

3.1.2 特点

放射免疫分析技术是用于检测肿瘤的一种超微量的分析技术，其主要特点是分离效果好、敏感性强、准确度高，其标记物是抗原。反应条件要求不高，但该分析技术所应用试剂具有一定的放射性，如果人体长期接触，会造成一定的危害。因而，试验人员在进行试验时，应做好自身防护，避免放射性对自身产生损害。同时，放射免疫分析技术所应用试剂还存在半衰期，因而，试验人员应做好试剂规划，以免试剂超过半衰期而会作废。

表1 不同检测肿瘤标志物的方法检测阳性率比较

3.2 免疫放射分析法

免疫放射分析法（immunoradiometrie assay，IRMA）又称酶免疫分析法，是由Miles和Hales在1968年提出的检测肿瘤标志物的方法。其与放射免疫分析技术（RIA）的最大区别是，免疫放射分析法是非竞争性抗原抗体结合反应，所用标记物是抗体。

3.2.1 原理

用过量I125标记的抗体与非标记抗原反应结合成抗体抗原复合物，然后用免疫吸附剂除去没有反应的抗体，抗体抗原复合物的放射性与所加非标记抗原的量呈正比关系。

3.2.2 特点

免疫放射分析法是属于非竞争性抗体抗原结合的反应；抗体抗原复合物的量与所加非标记抗原的量呈正比关系；免疫放射分析法的非特异抗体抗原结合对低剂量区影响较大，反应条件要求也比放射免疫分析法严禁很多。但其灵敏度较放射免疫分析法有所提高，虽然免疫放射分析法比放射免疫分析法灵敏度有了很大的提高，但该技术仅限于肽类和蛋白质，应用范围较小，很多小分子的半抗原不能应用此方法进行检测。而且，在进行本试验时，要特别注意待测抗原的浓度，如果测抗原的浓度过高，在试验过程中很容易出现”倒钩现象”，即待测抗原的浓度高，反而生成的复合物会有所下降。

3.3 酶标记免疫分析技术

酶标记免疫分析技术（enzyme immunoassay，EIA）是用酶分子来代替非特异性标记的抗原或抗体的分子的竞争性或非竞争性免疫分析的技术，近年来，酶联免疫吸附分析技术现在已被广泛应用于临床诊断肿瘤中。

3.3.1 原理

酶标记免疫分析技术的原理与放射免疫分析法基本相同，但酶标记免疫分析技术是在抗体分子上结合酶分子，进行结合反应，并将反应结合的复合物与未反应原的抗体分离开，取其反应的结合部分，利用酶的催化活性，将结合复合物上的标记酶将特定的底物转化为特殊的颜色，并应用紫外分光光度计进行含量测定，酶的量与颜色的深浅呈正比关系，而酶的量又与结合的复合物的量呈正比，由此可以计算出结合的复合物的量。

3.3.2 特点

此法既可用于测定蛋白类抗原，亦能用于测定可作为半抗原的类固醇激素等。

酶标记免疫分析技术的优点是对分光光度计的精确度要求不高，仪器的灵敏度较放免仪的灵敏度有所下降，但酶分子可以产生大量有色产物。会对对仪器的灵敏度给予补偿。因此，酶标记免疫分析技术法也同样具有较高的灵敏性。且本法不会产生危害。酶的标记物低温保存可稳定数月甚至几年。测定方法简便，酶免疫均相分析法尤为快速，且不需特殊设备，而灵敏度、准确性、特异性等堪与放射免疫分析法相比。

但本法易出现“倒钩”现象，使试验产生假阴性或抗原、抗体的含量比实际含量下降。另外，酶标记免疫分析技术试验都是一次性的，需要试验人员在特定时间内对显色反应进行读数。且不可以重复测量。

3.4 化学发光免疫分析技术

3.4.1 化学免疫发光分析

化学免疫发光分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA） 是一种非放射性标记免疫的分析技术，是应用可以产生化学发光性质的化合物代替放射性标记物质，从而根据发光信号的强弱来反应结合复合物含量的方法。

3.4.1.1 原理

化学免疫发光分析是以发光物质代替放射性核素或酶成为标记物，在反应条件下，发光物质在碱性介质中氧化时能够释放出大量自由能，生成激发态的中间体，该激发态的中间体由最低振动能级回到稳定的基态，各个振动能级时产生辐射，同时产生能量，多余的能量即为发光因子，从而产生发光现象。并应用发光信号的测量仪器对发出的光子量进行测定，分析光量子的产量，并通过计算机系统转换成复合物的浓度单位。

3.4.1.2 特点

化学免疫发光分析的优点主要是简便易行，并具有较高的灵敏度和稳定性，没有应用放射性元素，对人体不会造成危害，且便于实现全自动化和不对环境产生污染。但其发光时间较短，因而，试验人员要严格掌握检测时间，以避免对试验结果产生影响。但试验产生的发光分子只能使用一次，不可重复利用。

3.4.2 化学发光酶免疫分析技术

化学发光酶免疫分析技术（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是应用碱性磷酸酶来标记抗体的分析技术，底物应用的是环1，2—二氧乙烷衍生物。通过夹心法免疫反应，使结合成的复合物带有酶标记，酶能够促使反应底物断裂，而产生发光量子。化学发光酶免疫分析技术由于酶的存在，发光时间较化学免疫法的发光时间长，但其结果更准确。但试验所产生的发光量子只能应用一次，不可重复应用。

3.4.3 电化学发光免疫分析技术

电化学发光免疫分析技术（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是化学发光免疫分析中的新型的免疫标记的分析技术。是用三丙胺做为标记物，反应形成的复合物中含有三丙胺，三丙胺在电极周围会失去电子而成为还原剂。底物应用的是三价钉的化合物，该化合物在还原剂三丙胺的作用下还原成二价钉，同时发出光量子。发射光量子后的二价钉即还原成三价，又可再次被还原，再发射光量子，从而显著提高信号的强度。较化学免疫发光分析技术和化学发光酶免疫分析技术的结果更稳定可靠，信号明显增强发射的光子能反复利用等特点。

3.5 时间分辨荧光免疫分析技术

时间分辨荧光免疫分析技术（time—resolved fluoroim—munoassay，TrFLA）是20世纪80年代初Pettersson和Eskola等创立的一种免疫非放射性标记的分析技术，其标记物由镧系元素（如铕（Eu）、铽（Tb）、铌（Nd）等）通过一定的连接剂与抗体蛋白相连而组成。

3.5.1 原理

时间分辨荧光免疫分析技术的原理是应用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、酶和化学发光物质等，以标记抗原、抗体、核酸探针。通过免疫反应后，待测物形成的复合物上带有镧系元素，通常情况下应用的是铕元素。通过紫外线激发铕元素使其发出较长波长的荧光。在结合反应结束后，向反应体系中加入一个”荧光增强剂”，以增强荧光强度。且上述激发可以反复多次激发，因而，可大大提高信号的强度。直到荧光衰减到很低水平时反应才结束，此时停止记录。荧光强度与待测物的浓度相关，通过计算机数据处理系统测定出待测物的浓度。

3.5.2 特点

具有信号强，激发光谱带较宽，可提高标记物的比活性，同时发射光谱较窄，可提高分辨率，并能够缩短测量时间，提高灵敏度。但时间分辨荧光免疫分析技术的标记物和荧光增强剂制备过程难度大，且荧光增强剂中含一定量的有毒物质，如处理不当会对人体及环境产生较大损害，因而，在试验人员在应用增强剂时，要对废物进行严格的处理。

近年来，随着医学技术的提高以及肿瘤基础研究的深入，肿瘤标志物的检测得到了医务临床工作者的广泛重视[1-9]。同时，由于临床检测技能的不断提高以及检测方法的不断改进，肿瘤标志物检测的种类、水平以及它们的灵敏度和特异性也都有了很大的进步。检测的灵敏度、特异性以及准确性的不断提高，为肿瘤患者的早期诊断和早期治疗提供了更加可靠的理论依据。本研究通过对我院收治的107例肿瘤患者肿瘤标志物的检测方法的诊断准确性进行了探讨，应用五种肿瘤标志物的检测方法，放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶标记免疫分析法、化学免疫发光分析法、时间分辨荧光免疫分析法对肿瘤患者进行检测，结果显示，时间分辨荧光免疫分析法对肿瘤患标志物的检测阳性率最高。除了肺癌检测阳性率为90.91%外，其余均为100%。

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