河北省风疹病毒的分离鉴定及基因型分析

杜慧 郭玉 赵娜 朱贞 王晶辉 刘岩 张振国 许文波 李琦

风疹是儿童时期常见的传染病，成人也可感染，表现为发热，全身性皮疹，枕下、耳后及颈部淋巴结肿大和疼痛，孕妇在妊娠早期感染风疹病毒，可引起胎儿受感染，发生先天性风疹综合症(CRS)［1］，造成发育迟滞和胎儿畸形等严重后果。目前发现有多种病毒性感染所引起的症候群与风疹相似，风疹亦可产生非典型的临床表现或亚临床感染［2］。因此，临床诊断风疹并不可靠，往往需要实验室诊断证实，病毒分离作为可靠的实验室诊断方法已被广泛采用，但因风疹病毒的细胞病变(CPE)进展缓慢且较难分辨，目前多采用病毒分离结合逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行鉴定。为了解河北省风疹流行特征，并为我省风疹控制工作提供分子流行病学的基线数据，采用病毒分离与RT-PCR相结合的方法对我省2011年发热出疹病例咽拭子标本进行了鉴定，并对分离到的风疹病毒的基因特征进行了分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 所有标本均为采自于2011年1月至9月底疑似风疹病例的咽拭子。标本采集后保存在2 ml标本运输液中，24 h内冷藏运输到省级疾病预防控制中心(CDC)麻疹/风疹实验室进行病毒分离，－70℃保存备检。

1.2 病毒分离 咽拭子标本融化后取0.2 ml原液接种到长成单层的Vero/SLAM细胞上，于37℃培养，同时做好阴性细胞对照，每天观察培养液的pH值及细胞状态，7～10 d后将细胞培养管依次置于－70℃和室温之间，待标本融化后依上述方法盲传三代再进行鉴定。

1.3 风疹病毒RNA的提取及荧光定量PCR鉴定 使用Qiagen公司的QIAanp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取标本悬液中的病毒核酸;使用迅必达公司的麻疹和风疹病毒核酸双重检测试剂盒(实时荧光PCR法)进行荧光定量PCR的鉴定。风疹病毒阳性者送国家麻疹实验室进行E1基因核苷酸序列测定和分析。

1.4 生物信息学分析 序列整理使用Sequencher 4.0.5软件(GeneCode，Ann Arbor，Michigan，USA)，将 1107 个核苷酸片段序列截成用于分子流行病学监测所需的739个核苷酸片段(8731nt～9469nt);多序列比对、氨基酸和核苷酸同源性分析使用BioEdit Sequence Alignment Editor software(North Carolina St.University，USA)，Version 7.0.5.1;基因亲缘性关系树使用Mega 4.0 软件(Sudhir Kumar，Arizona State University，Arizona，USA)中的邻接法构建，建树的可靠性通过1000bootstrap来评估。

2 结果

2.1 风疹病毒的分离和鉴定 2011年截止到9月底共收集发热出疹病例咽拭子标本118份，在Vero/SLAM细胞上进行病毒增殖和分离后，全部进行了荧光定量PCR的鉴定，共分离出24株风疹病毒阳性标本，分布于全省8个市，其中保定7株(编号为:63、64、97、99、103、105、118)，石家庄 6 株(编号为:16、25、39、40、53、65)，廊坊 3 株(编号为:110、111、114)，承德、秦皇岛、唐山各2 株(编号分别为 57、58;86、87;109、117)，沧州、张家口各1株(编号分别为77;91)。荧光定量PCR结果以下图为例，见图1。

图1 麻疹、风疹病毒核酸双重检测扩增曲线

2.2 风疹病毒基因型的确定 将24株风疹病毒E1基因的739个核苷酸片段进行核苷酸序列测定和分析，并与WHO风疹病毒13个基因型的32株参考株相对应的核苷酸片段共同构建基因亲缘关系树［3，4］，结果显示，分离的24株阳性毒株中有1株与WHO 2B基因型参考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)同属一个分支;其余23株与2株WHO 1E基因型的参考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)同属一个分支，而这些毒株又与分离于中国的参考株T14-CH-02株自成一簇，形成一个独立的分支。因此可以确定，此23株风疹病毒阳性株属于1E基因型，1株风疹病毒阳性株，即Hebei-SJZ-16属于2B基因型。图2所示为河北省风疹病毒阳性分离株与WHO基因参考株基于E1基因739个核苷酸构建的基因亲缘性关系树。

图2 河北省风疹病毒阳性分离株与WHO基因参考株构建的基因亲缘性关系树

2.3 风疹病毒株核苷酸和氨基酸变异分析 在分离到的24株风疹病毒株中，23株1E基因型风疹病毒之间的核苷酸同源性为98.3% ～100%，氨基酸同源性为99.5% ～100%。23株1E基因型风疹病毒与WHO 1E基因型参考株(T14-CH-02株和M1-MAL-01株)之间核苷酸同源性分别为98.4% ～100%和96.8% ～100%，氨基酸的同源性分别为99.1% ～100%和99.1% ～100%。分离到的1株2B基因型风疹病毒与WHO 2B基因型参考株(TAN-IND-00株、TS34-CH-00株和I11-IS-68株)之间核苷酸同源性分别97.9%、96.4%和94.8%，氨基酸的同源性分别为100%、99.5%和99.5%。

河北省风疹病毒阳性分离株E1基因739个核苷酸中共有38个核苷酸发生变异。将24株风疹病毒分离株E1基因739个核苷酸推导的氨基酸序列与WHO各基因型参考株E1基因739个核苷酸推导的氨基酸序列进行比对，发现核苷酸变异为无义突变，氨基酸序列高度保守，N-型糖基化位点、血凝抑制位点和中和位点未发生改变，并且发现，1E基因型风疹病毒E1蛋白在第338位的氨基酸发生相同的突变，均突变为Phe338。

3 讨论

风疹病原体是一种单链RNA病毒，有一个血清型，多个基因型。世界卫生组(WHO)将E1基因的739个核苷酸(8731-9469nt，159-404aa)作为基因型划分和常规分子流行病学研究的标准靶序列，并将全球流行的风疹病毒划分为两个进化枝(Clade 1和Clade 2)，其中 Clade 1包括6个基因型(1B、1C、1D、1E、1F、1G)和4 个临时基因型(1a、1h、1i、1j);Clade 2 包括3个基因型(2A、2B、2C)［5］。我国自2001 年发现1E 基因型之后，该基因型逐渐成为我国优势流行基因型，我国各省的风疹爆发主要与1E基因型风疹病毒有关［6］。然而，当前2B基因型风疹病毒的传播未被阻断，如2000年安徽省监测到2B基因型风疹病毒，2006年四川省报道从越南输入2株2B基因型风疹病毒［7］，但从流行情况看，2B基因型风疹病毒在中国的流行为弱势。通过河北省风疹病毒的分析结果可以看出，2011年河北省分离到的毒株以1E基因型为主，因此我们推断1E基因型风疹病毒可能是河北省主要的本土流行株。河北省于2011年监测到一株2B基因型风疹病毒，提示我们今后应密切关注2B基因型在河北省的流行情况。从基因亲缘性关系树中还可以看出，同一市区在同一年份内引起风疹流行的传播链有所不同，如Hebei-BD-64与Hebei-BD-105;不同的市区之间存在着相同的病毒传播链，如Hebei-TS-117与Hebei-QHD-87，提示河北省风疹病毒流行是由1E基因型风疹病毒的多个传播链引起的，且无明显的地理分布倾向。

朱贞等［6］发现我国1E基因型风疹病毒在E1蛋白的第338位氨基酸为Phe338，而其他基因型及其他国家的1E基因型风疹病毒E1蛋白的该位点的氨基酸为 Leu338，氨基酸Phe338为我国风疹病毒E1蛋白所特有。河北省分离到的1E基因型风疹病毒中，E1蛋白的第338位氨基酸同样为Phe338，符合我国1E基因型的流行特征，检测结果又进一步验证了朱贞等［6］的研究结论。

2011年，河北省建立了荧光定量PCR的方法检测风疹病毒，该方法特异性好，灵敏度高，操作简单安全，自动化程度高，不易污染，弥补了河北省只能依靠血清学检测或临床表现发现感染风疹病毒病例的空白。同时，河北省使用了双重检测试剂盒，同时检测麻疹、风疹两种病毒，能够快速的对病例进行确定诊断，指导基层进行处置，经过近一年的实践取得了良好的效果。

河北省首次成功分离出风疹病毒，并确定了河北省风疹病毒本土基因型，即以1E基因型风疹病毒流行为主，同时存在弱势的2B基因型风疹病毒的流行。今后应继续加强监测，从而获得更加完整的监测数据，指导河北省风疹流行的控制工作。

1 Frey TK.Molecular biology of rubella virus.Adv Virus Res，1994，44:69-160.

2 卢锦汉，章以浩，赵铠主编.医学生物制品学.第1版.北京:人民卫生出版社，1995.619.

3 WHO.Global distribution of measles and rubella genotypes-update.WER，2006，81:474-479.

4 WHO.Update of standard nomenclature for wild-type rubella virus，2007.WER，2007，82:216-222.

5 朱贞，郭学斌，崔爱利，等.中国2007-2008年风疹流行病学和病毒基因特征分析.中国疫苗和免疫，2009，20:201-204.

6 朱贞，许文波，毛乃颖，等.2003-2007年中国风疹病毒基因特征分析.病毒学报，2008，24:7-16.

7 何吉兰，朱贞，孙莉，等.四川省首次分离出的风疹野病毒的基因型分析.现代预防医学，2007，34:1751-1752.