动态QCM生物传感器检测尿微量白蛋白及过程分析

刘宪华，赵 勇，张 林，冯梦南，赵友全，鲁逸人

动态QCM生物传感器检测尿微量白蛋白及过程分析

刘宪华1，赵 勇1，张 林1，冯梦南1，赵友全2，鲁逸人1

(1. 天津大学环境科学与工程学院，天津 300072；2. 天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072)

尿微量白蛋白(HSA)的检测对肾损伤的早期诊断及治疗具有重要意义．通过搭建基于石英晶体微天平(QCM)原理的免疫型生物传感器，对尿微量白蛋白实现动态实时的检测．首先使用硫辛酸修饰石英晶体表面，形成自组装单分子膜，然后再用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化晶体表面的羧基，使得HSA抗体能够与之结合．实验通过记录传感器的频率变化，反映被测HSA样品的浓度大小．通过测定不同浓度的HSA，确定所搭建的生物传感器对HSA的检测范围是0.1～6,µg/mL，最小检测质量浓度0.1,µg/mL，频率变化和样品浓度的拟合曲线为y=11.276x+10.351，拟合优度R2为0.999 4．在检测范围内，两者线性关系较好．

石英晶体微天平(QCM)；循环伏安法；抗体；尿微量白蛋白；检测

人血清白蛋白是血液中一种重要的蛋白质，具有很多生理功能．正常情况下部分血清白蛋白可通过肾小球滤过膜，但几乎皆被肾小管重吸收．当肾小球病变时，血清白蛋白滤过量增多，不能被肾小管全部重吸收而从尿中排出，形成尿微量白蛋白(human serum albumin，HSA)．传统的测定尿白蛋白的方法有酶联免疫法、放射免疫法、免疫比浊法和高效液相色谱法[1-2]．酶联免疫法检测时间较长；放射免疫法灵敏度、精确度较高，但是存在放射性污染；免疫比浊法简单方便，但试剂昂贵不适合大批量的样本筛选；高效液相色谱法处理过程复杂，操作过程繁琐[3]．石英晶体微天平(QCM)的理论基础是Sauerbrey方程，即Δfm=-2.3×106,f02Δm/A[4]．对于AT切型石英晶体的质量响应型石英晶体微天平，在适当的条件下，晶体振动频率移动Δf与在晶体表面沉积的质量变化Δm之间呈简单的线性关系．自20世纪80年代在液相中获得成功振荡以来在化学分析、病毒检测[5-6]以及环境污染物监测[7]等领域逐步得到了应用．基于免疫反应原理的QCM传感器的研究近几年得到迅速发展．抗原和抗体作为大分子蛋白质在石英晶体表面的结合，可以使晶体产生显著的质量变化，因而大大提高了QCM检测的灵敏性和特异性[8]．李辉等[3]用SPR来检测尿微量白蛋白，可以测到0.1,µg/mL，但是相对QCM，仪器设备价格偏高．而相对于ELISA，QCM不需要对抗体进行标记，检测方法建立更为容易．罗阳等[9]采用葡萄球菌A蛋白法固定石英晶体微阵列上来检测尿微量白蛋白，检测范围0.01～20,µg/mL，但是实验是用静态人工添加抗原抗体的方法来进行检测，不能短时间内在同一个石英晶体单元上进行连续的检测，同时在一个石英晶体单元上检测不同浓度的尿微量白蛋白时，会由于人为操作的原因带来较大的系统误差．

笔者利用硫辛酸在石英晶体表面形成自组装单层膜(SAMs)，用蠕动泵进样，可以用在线动态检测频率变化的方法来表征NHS/EDC在石英晶体表面的结合以及不同浓度的尿微量蛋白跟抗体的结合过程，进而实现对尿微量白蛋白的动态检测．

1 实 验

1.1 试剂与仪器

仪器：CHI 440A电化学工作站和石英晶体购于上海辰华仪器有限公司；石英晶体为AT切面，8 MHz基频，直径25.1,mm，上下两面分别镀有直径为12.25,mm的金膜；石英晶体微天平及单通道流通池为本研究室设计组装；HL-2D定时数显蠕动泵购于上海沪西分析仪器厂有限公司．

试剂：HSA(相对分子质量66,000)购自欣经科生物技术有限公司；鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体(相对分子质量150,000)购自北京赛驰生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，10,mmol/L，pH值为7.4；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(吐温20)，牛血清白蛋白(BSA)，购自美国Amresco公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，购自上海共价生化有限公司；硫辛酸、铁氰化钾、氯化钾都为分析纯级；实验用水皆为超纯水．

1.2 石英晶体金膜表面硫辛酸SAMs的电化学表征

将在0.3,mol/L硫辛酸浸泡12,h后的石英晶体放入CHI 440A电化学工作站的反应池中进行循环伏安实验，并记录CV图．以石英晶体接触溶液的镀有金膜的表面作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极．

1.3 QCM生物传感器制备

石英晶体表面用Piranha溶液(30% H2O2和98% H2SO4按体积比1∶3的比例配制)清洗3,min，接着用乙醇冲洗3遍，二次蒸馏水冲洗3次后用氮气吹干[7]．接着将石英晶体浸泡在质量分数为0.3%的硫辛酸乙醇溶液内静置12,h[10]．将修饰好的石英晶体取出后用乙醇冲洗3遍，用二次蒸馏水冲洗3次，氮气吹干后放置到QCM反应池内．将0.4,mol/L NHS和0.1,mol/L EDC水溶液等体积混合，用流速15,µL/min的蠕动泵将其注入反应池，1,h后再用PBS缓冲液冲洗．NHS/EDC能活化自组装单层膜上的羧基，活化后的羧基可以跟抗体中的氨基发生缩合反应，形成共价键，这样就可以将抗体固定到石英晶体的表面[5]．配制含有0.005%(质量分数)吐温20的PBS缓冲溶液(PBST)[7]，用蠕动泵把含有0.1,mg/mL抗体的PBST缓冲液注射到反应池内，在流速15,µL/min下流动10,min后静置40,min．之后再用PBST缓冲液冲洗3,min．为了防止晶体表面没有结合上抗体的位点影响实验，用蠕动泵将质量分数为0.3%的牛血清蛋白(BSA)的PBST缓冲溶液注入反应池，流速15,µL/min，封闭没有结合的位点[11]．30,min后用PBST冲洗3,min．

1.4 HSA的检测

配置了不同浓度HSA的PBST溶液，质量浓度范围是0.1～20,µg/mL．记录频率改变，考察相应的检测线性范围、灵敏度等指标．

2 结果讨论

2.1 电化学表征分析石英晶体金膜表面硫辛酸SAMs

用循环伏安法表征石英晶体金膜表面修饰的SAMs．取0.5,mL 0.1,mol/L的K3Fe(CN)6，加入5,mL的1,mol/L的硝酸钾，在50,mL的容量瓶里定容．取上述混合溶液1,mL，滴加到电化学工作站的反应池内进行循环伏安实验．取0.3,mol/L α-硫辛酸0.5,mL，加入到反应池内，静置12,h，作金膜的表面修饰．通过对比修饰前后的循环伏安曲线来表征硫辛酸形成的自组装单层膜．

分别将未经修饰和修饰过的石英晶体在铁氰化钾溶液中进行循环伏安扫描，如图1和图2所示．扫描范围是-0.2～0.9,V，扫描速率是0.1,V/s．通过比较图1和图2可以看到，在没有修饰的金电极上铁氰化钾的还原峰电流值是-45.54,μA，峰电位差是0.1,V．当硫辛酸中的巯基结合到石英晶体表面后，电子向金膜表面的转移就会被阻碍．从图2可以看出晶片修饰后氧化还原峰电流值变小，峰电位差变大，为0.42,V，并且氧化还原峰的峰形变得不对称，由此可以得出硫辛酸在金膜表面形成了一层自组装单层膜[12]．

图2 石英晶体修饰之后的循环伏安曲线Fig.2 CV curve of quartz crystal after modification

2.2 抗体的固定以及BSA封闭

将已形成硫辛酸SAMs的石英晶体固定在流通池中，用蠕动泵通入NHS/EDC，结果如图3所示．由图3可知，由于NHS/EDC活化了硫辛酸上的羧基，导致起到架桥作用的功能集团固定到了石英晶体的表面，从而引起频率减小约30,Hz．

将抗体固定到晶体表面后，向反应池里通PBST缓冲溶液，待频率稳定后再向反应池中加入含有质量分数为0.3% BSA的PBST缓冲溶液，15,min后频率趋于稳定后再用PBST缓冲溶液冲洗，将那些结合不牢固的BSA冲洗掉，整个过程如图4所示．由图4可以看出，BSA封闭前后频率变化了约30,Hz．

图3 NHS/EDC的作用引起的晶体频率下降Fig.3 Decrease of the resonance frequency of the quartz crystal due to the adsorption of NHS/EDC

图4 BSA的封闭作用引起的晶体频率下降Fig.4 Decrease of the resonance frequency of the quartz crystal due to the blocking of BSA

2.3 生物传感器的应用

2.3.1 尿微量白蛋白的检测

配置5个不同浓度HSA的PBST溶液，浓度范围是0.1～20,µg/mL．测量时的流速为15,µL/min，整个测量过程都以此流速为准．

向反应池通入PBST 8,min后频率趋于稳定，再通入质量浓度为10,µg/mL的HSA，10,min后停止进样，静置5,min后再通入0.1,mol/L HCl溶液进行传感器的再生，再生时间为5,min[7]．通入不同浓度的HSA并重复上述过程．图5所示为在线检测HSA的整个过程，由图5可看出频率变化趋势具有很好的规律性．图6为将含有10,µg/mL HSA通入有固定抗体和没有抗体的石英晶片进行比较，结果显示没有固定抗体的石英晶体，通入HSA后频率没有明显的变化.

针对0.1,µg/mL、0.5,µg/mL、1,µg/mL、2,µg/mL和6,µg/mL 5种浓度的HSA分别进行了3次重复实验．以HSA浓度和频率变化的平均值做标准曲线，见图7．由图7可知，当HSA的质量浓度在0.1～6,µg/mL范围内，随着HSA浓度的增加，其吸附晶体表面引起的频率变化值呈线性增加．用y表示频率变化值，x表示抗体浓度，得线性方程y=11.276,x + 10.351，拟合优度R2为0.999 4．

图6 修饰抗体的石英晶体对HSA的频率响应Fig.6 Frequency responses of antibody modified quartz crystal to HSA

图7 不同HSA浓度的标准曲线Fig.7 Standard curve for different mass concentrations of HSA

2.3.2 检测限的确定

在0.01～1,µg/mL范围内，取5种浓度的HSA分别进行了3次重复实验，测试结果见表1．当HSA的浓度为0.1,µg/mL时，频率变化值为(11.33± 1.15)Hz，继续降低浓度至0.05,µg/mL时无规则信号，可以确定自组装传感器同步检测尿微量白蛋白的检测限为0.1,µg/mL．

2.3.3 传感器的再生

石英晶体芯片的重复使用是QCM生物传感器具有实用价值的一个重要指标．抗原与抗体间的键合主要用一定浓度的酸、碱及高离子强度的溶液洗脱，本实验采用0.1,mol/L HCl作洗脱液，实验结果表明0.1,mol/L HCl能使HSA有效地被洗脱且石英晶体芯片可重复多次使用．

表1 QCM生物传感器检测限的确定Tab.1 Determination of the detection limit of QCM biosensor

2.4 传感器重现性分析

为了验证本实验所用固定方法是否具有可以重复利用和具有良好的物理化学稳定，因此将传感器的重现性作为一个重要考查指标．实验中以流速15,µL/min向反应池中通入质量浓度2,µg/mL的HSA，待频率稳定后，纪录频率的变化，再洗涤除去金电极上的尿微量白蛋白，重复以上程序，7次测量相应的频率．实验结果表明频率有下降趋势，可能是由于部分尿微量白蛋白没有被洗涤干净，或是其他原因，但是不会对测定结果产生严重的影响．得到的相对标准偏差(RSD)为5.3%(n=7)，用该种方法检测尿微量白蛋白有良好的重现性．

3 结 语

用硫辛酸形成的自组装单分子层所构建的石英晶体微天平来检测尿微量白蛋白，检测范围在0.1～10,μg/mL内，呈现良好的线性关系，与传统的ELISIA技术相比较，具有快速、简单以及更适合于现场检测的特点．实现在一个反应池上连续动态的检测，相对于静态的石英晶体微天平，节省时间，便于操作，整个装置更加稳定．通过对硫辛酸自组装单层膜的电化学检测，验证了硫辛酸形成的自组装膜能够满足尿微量白蛋白的测定，此平台的建立为新一代压电石英谐振传感器用于临床标本检测奠定了基础．

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Dynamic QCM Biosensor Detection of Human Serum Albumin and Process Analysis

LIU Xian-hua1，ZHAO Yong1，ZHANG Lin1，FENG Meng-nan1，ZHAO You-quan2，LU Yi-ren1
(1. School of Environmental Science and Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. School of Precision Instrument and Opto-Electronics Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

The screening of urine human serum albumin (HSA) is significant for the early diagnosis and intervention of the nephropathies. An immunosensor based on a quartz crystal microbalance (QCM) was developed for dynamic and real-time detection of HSA. Firstly，quartz crystal resonator was modified with lipoic acid and a self-assembly monolayer was formed on the surface. Then，carboxyl group on the modified surface was activated with 1-(3-(dimethylamino)propyl)-3-ethylcarbodimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) in order to couple anti-HSA antibody. In this experiment, the frequency changes were recorded by QCM biosensor and were related to HSA concentrations. The results show that HSA can be quantitatively detected with the developed immunosensor within the mass concentration range of 0.1—6 µg/mL. Minimum detectable mass concentration of the biosensor is 0.1 µg/mL. The linear equation between frequency response and HSA concentration is y=11.276x + 10.351 with R2= 0.999 4. In the range of detection，the linear relationship is satisfactory.

quartz crystal microbalance(QCM)；cyclic voltammetry；antibody；human serum albumin(HSA)；detection

O657

A

0493-2137(2012)07-0604-05

2011-03-16；

2011-08-10.

天津市自然科学基金资助项目(08JCYBJC02900)；天津市自然科学基金重点资助项目(09JCZDJC25700).

刘宪华（1974— ），男，博士，副教授.

刘宪华，lxh@tju.edu.cn.