四物汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

王 茜

（江苏省昆山市中医医院· 215300）

缺血性脑中风是临床上最常见的脑血管病之一，具有致死率高和致残率高的特点，其发病率随年龄的增长呈直线上升趋势。探索一种既可以最大限度地减少医源性风险又能有效地保护大脑的药物是当今医疗界所面临的重要课题。中药四物汤由白芍、当归、川芎和地黄组成，用于妇科疾病、痈疽、慢性炎症的治疗。实验表明四物汤能增强血清超氧化物歧化酶活力，促进自由基消除，同时具有抗辐射、抗突变及调节内分泌等作用[1]。关于它是否具有保护大鼠对抗脑缺血再灌注损伤的作用未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠共60只，清洁级，体重200～240g；由上海西普尔-必凯实验动物有限公司实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器

栓线（北京沙东生物科技有限公司），TTC(美国Sigma公司)，水合氯醛（国药集团），生理盐水注射液（民生药业），电子天平（AG285，梅特勒-托利多，德国），电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）

1.3 大鼠脑缺血再灌注模型制备

按实验设计随机分组，动物用10%水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，在近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始计算距离，当插入深度约18mm时，记录栓线插入的时间，同时紧紧系牢CCA远心端的细线，缝合伤口，整个手术过程采用恒温系统维持动物体温在37℃。插入栓线2h后轻轻地将栓线拔出10mm左右从而实现脑缺血后的再灌注。实验结束后，大鼠常温分笼饲养。

1.4 药物来源及给药方案

四物汤由本院提供。经生理盐水稀释后，于大鼠脑缺血发生前4h灌胃给药，本方案共分为5组，分别为假手术组、生理盐水组、100mg/kg组、200mg/kg组及300mg/kg组。其中四物汤给药组生药量终浓度分别为1，2，4g/L，给药体积均为1mL，其中生理盐水组给予等体积的生理盐水溶液。

1.5 脑相对梗死体积评测

大鼠缺血后24h，水合氯醛麻醉处死，断头取脑，除去小脑和低位脑干、嗅球，将剩余脑组织沿冠状面切成5片，每片厚2mm，脑片置于2%的TTC溶液中37℃避光孵育30min。正常的脑组织染成红色，梗死组织成白色。拍照，用图像分析软件ImagePro-Plus4.5测量并计算各组大鼠梗死面积，然后用下述公式计算相对梗死体积以排除脑水肿对统计造成的误差[2]。

相对梗死体积(%)=（未损伤测大脑总体积-损伤测未梗死体积）/未损伤测大鼠脑总体积×100%

1.6 大鼠神经学功能评分

分别于缺血后6h及24h按照Bederson5分制评分，采用秩和检验进行统计分析。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向右侧转圈；3分：向右侧颠倒；4分：不能自发行走，甚至意识消失。

1.7 脑水含量测定:

于缺血24h后断头取脑, 将左右脑分别置于预先称重的试管中, 以电子天平( 分度值为0.1mg)称取重量, 然后放入95℃ 恒温烘干箱中烘烤24小时至恒重, 再次称重后, 按下述公式计算脑水含量: 脑水含量(% )=( 湿重- 干重)/湿重×100%

1.8 数据统计与分析

数据采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计，使用SPSS 17.0 进行Tukey或Scheffe组间分析，组间神经功能评分采用秩和检验，P＜0.05认为具有统计学差异。

2 结果

2.1 四物汤能减少缺血大鼠的脑相对梗死体积

为了探讨四物汤对缺血性脑中风的潜在治疗作用，大鼠缺血前4h通过灌胃给予不同剂量的四物汤。再灌注24h结束后，取脑进行TTC染色（图1）。红色部分代表未梗死区域，白色部分代表梗死区域。通过对脑梗死体积统计分析，结果显示， 200mg/kg及400mg/kg四物汤治疗组的相对梗死体积显著地小于生理盐组（*P＜0.05、**P＜0.01 vs 生理盐水组，n=7）。

图1 四物汤对大鼠脑梗死体积的影响

2.2 四物汤能减轻大鼠缺血所致的神经功能损伤

为了观察四物汤治疗对大鼠神经功能评分的影响，于给药后24h，按照上述方法对大鼠进行神经功能评分，并采用秩和检验分析组间差异。结果显示，仅400mg/kg四物汤治疗能显著地改善大鼠神经功能（**P＜0.01 vs生理盐水组，n=7）（图2）。

图2 四物汤对大鼠神经功能的影响

2.3 四物汤能够减少缺血大鼠的相对脑水含量

在临床上防治脑水肿是治疗脑缺血过程中的一项重要治疗原则。而脑水含量的变化直接反映脑水肿的程度。因此，我们选取脑水含量来考察四物汤对脑缺血再灌注损伤的保护作用。结果显示，200mg/kg及400mg/kg四物汤治疗组能够显著地减少减少缺血大鼠的相对脑水含量（**P＜0.01 vs 生理盐水组，n=5）（图3）

图3 四物汤对大鼠相对脑水含量的影响

3 结论与讨论

本研究考察了不同剂量的四物汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，研究结果显示，当大鼠脑缺血前经灌胃给予一定剂量四物汤治疗能够明显减轻缺血再灌注诱导的脑损伤，并且该保护作用呈剂量依赖性。四物汤治疗显著地缩小了脑梗死体积，减轻了神经功能的损伤并减轻了脑水肿。该结果为研究开发治疗缺血性脑中风的药物提供了可能。众所周知，过量的自由基损伤是造成脑缺血特别是再灌注时期大鼠脑损伤重要机制之一。文献显示，四物汤具有一定的清除自由基损伤的作用，该作用可能是四物汤发挥上述保护作用的机制之一。研究发现，当归作为四物汤中重要组分，其有效成分当归内酯能减少局灶性的脑缺血损伤[3]。此外，当归和川芎中有效成分藁本内酯具有良好的改善微循环作用,可用于防治与微循环障碍有关的疾病[4]。以上机制只是结合已有研究所做猜测，其确切的保护作用机制有待进一步研究。

[1]张荣桃. 四物汤的现代研究进展[J].北京中医药,2012,31(1):73-75

[2]Joshi CN, Jain SK, Murthy PSR ( 2004). An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Brain Research Protocols 13(1): 11-17.

[3]张光毅,杜俊蓉,旷喜等. 当归内酯治疗大鼠局灶性脑缺血的作用机制[J]. 华西药学杂志.2006 ,21(2):114-117

[4]汪程远,杜俊蓉,钱忠明.藳本内酯研究进展[J]. 中国药学杂志,2006, 41(12):889-890