HPLC法测定复方α酮酸片中四种氨基酸的含量

2012-06-06陆继好

中国医药导报 2012年18期

蒋燕陆继好

1.无锡卫生高等职业技术学校，江苏无锡 214111；2.无锡信孚医药技术有限公司，江苏无锡 214028

复方α-酮酸是2000年和2004年国家医保目录品种以及国家基本药物（2004年），临床应用于慢性肾衰患者的营养，延缓肾衰进展，纠正代谢紊乱，复方α-酮酸的口号是：拨慢肾衰进展的时钟。它由4种酮酸、1种羟酸和5种必需氨基酸配方制成，其中酮酸和羟酸以钙盐形式存在。酮酸或羟酸经过酶的转氨基作用合成相应的必需氨基酸，同时尿素氮被降减，通过再利用含氮代谢产物减少尿毒症毒素的蓄积，改善尿毒症症状；通过肾小球的高滤过，降低血磷和PTH水平延缓慢性肾衰的进程，从而推迟开始透析的时间；补充必需氨基酸则纠正基酸代谢紊乱，改善营养状况[1]。复方α-酮酸片中5种氨基酸除色氨酸外其他均无紫外吸收的特征，文献资料大多采用柱前衍生法，以邻苯二甲醛（OPA）和2-巯基乙醇为衍生化试剂，室温碱性条件下（PH约9.5）迅速产生本品的一级氨基酸反应，生成具有强荧光的产物1-硫代-2-烷基-异吲哚（紫外波长 335 nm，荧光波长 λEx=340 nm，λEm=450 nm）[2-10]。文献方法有5种氨基酸一次性测定方法，由于5种氨基酸的极性相差较大，此方法无法兼顾所有峰的峰形，易产生较大的测量误差，参照高效液相色谱法（《中国药典》2005年版二部附录ⅤD），选用最常用的紫外检测器测定含量，建立4种氨基酸的HPLC测定方法，经方法学研究，该方法准确方便，适合复方α-酮酸片中氨基酸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（日本岛津公司）：SPD-10AVP紫外检测器；LC 10ATVP梯度泵，AT-130柱温箱。

1.2 样品

复方-α 酮酸片（开同片），批号：20060701、20060702、200 60703，江苏信孚药业有限公司；对照品：苏氨酸（Thr）、组氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、醋酸赖氨酸（Lys-HAc）的含量均不少于99.0%。

1.3 试剂

乙腈为色谱纯；无水醋酸钠、冰醋酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、邻苯二甲醛（OPA）和2-巯基乙醇为分析纯；水为重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 衍生化试剂的制备

精密称取邻苯二甲醛（OPA）0.025 g，用甲醇1 mL溶解，加 2-巯基乙醇 100μL，0.4 mol/L硼酸溶液（PH 9.5，用氢氧化钠溶液调节）定容至10 mL（当天配制）。

2.2 流动相的选择

选择资料RP-HPLC梯度洗脱，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，经试验，发现各氨基酸的分离较差。然后改用乙睛-0.05 mol/L的醋酸钠缓冲液二元流动相梯度洗脱，此时除色氨酸外其他4个氨基酸的峰形好，4个峰均能被很好的分离，保留时间适中，柱效好。

2.3 色谱条件

仪器：LC-10ATVP液相色谱仪（日本岛津）SPD-10AVP紫外检测器（日本岛津）N-2000双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；色谱柱：Lichrospher C18（25 cm×4.6 mm）；检测波长：335 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃；流动相：A液为乙腈（100%），B液为0.05 mol/L的醋酸钠（冰醋酸调节PH为4.5）。梯度洗脱色谱条件见表1。

表1 梯度洗脱色谱条件

2.4 衍生化反应的条件

2.4.1 衍生化试剂的加入量精密称取对照品适量，用水溶解稀释至每毫升含赖氨酸醋酸盐约105μg/mL，苏氨酸约53μg/mL，组氨酸约38μg/mL，酪氨酸约30μg/mL的溶液，作为对照品溶液。分别精密量取衍生化试液与对照品溶液（1∶1、1∶2、1∶3）反应，分别取 20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。经试验，结果表明：衍生化试液与对照品溶液1∶1反应，衍生剂影响干扰较大；衍生化试液与对照品溶液1∶3反应，反应不完全；衍生化试液与对照品溶液1∶2反应，浓度适中，反应较完全，故确定样品溶液与衍生化试液的衍生比例为2∶1。

2.4.2 衍生物的定性分别取赖氨酸醋酸盐、苏氨酸、组氨酸、酪氨酸适量，分别用水溶液稀释制成约含105、53、38、30μg/mL的溶液，衍生量同上，各吸取20μL分别注入色谱仪，对每个峰进行定性。出峰顺序依次为：组氨酸、苏氨酸、酪氨酸和赖氨酸醋酸盐。

2.4.3 衍生物的反应时间精密称取对照品适量，用水溶解稀释至每毫升含赖氨酸醋酸盐约105μg/mL，苏氨酸约53μg/mL，组氨酸约38μg/mL，酪氨酸约30μg/mL的溶液，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液400μL与衍生化试液200μL在室温下分别反应2、3、4、5、10 min后测定各氨基酸的峰面积，结果见表2。

表2 衍生物反应时间比较试验

试验结果表明：衍生化反应的时间对试验结果有较大影响，随着衍生化时间的延长，部分衍生物峰面积变化较大并且下降，产生降解，但在2～4 min之间，峰面积变化很小，RSD小于1.5%。故反应过程确定为样品溶液与衍生化试液2∶1混合后，振荡30 s，准确控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色谱仪。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 系统适应性试验精密称定复方α-酮酸片（批号：20060702）适量，按含量测定项方法制备样品溶液，立即精密吸取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。见图1。苏氨酸理论板数为4 402，峰形较好，每个色谱峰的分离度均大于1.5，说明系统适应性良好。

2.5.2 辅料的影响试验取辅料适量，按供试品溶液制备项下的方法制备空白溶液，同法衍生后按上述条件进样，记录色谱图。见图2。结果表明：空白辅料对各氨基酸（除色氨酸）含量测定无干扰。

2.5.3 标准曲线绘制精密称取各种氨基酸对照品，以水配成合适浓度的贮备液，精密量取适量，以水稀释成系列浓度，按上述方法衍生后HPLC进样，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，作线性回归。结果组氨酸工作曲线为Y=58 383X+14 109，r=0.999 2，表明组氨酸在 12.62～126.20 μg/mL的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系；苏氨酸工作曲线为Y=90 597X-20 981，r=0.999 8，表明苏氨酸在18.65～186.50μg/mL的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系；酪氨酸工作曲线为Y=43 058X+19 757，r=0.999 2，表明酪氨酸在12.27～122.70μg/mL的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系；赖氨酸醋酸盐标准工作曲线为Y=20 174X-13 989，r=0.999 6，表明赖氨酸醋酸盐在34.23～342.30μg/mL的浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.5.4 回收率试验在按处方比例配制的空白辅料中分别加入处方量的80%、100%、120%的各氨基酸对照品，制成模拟样品各100片的量，精密称取不同水平模拟样品各3份，照含量测定方法测定，并计算回收率，结果表明：该方法准确度良好，见表 3～6。

表3 组氨酸含量测定回收率结果

表4 苏氨酸含量测定回收率结果

表5 酪氨酸含量测定回收率结果

表6 赖氨酸醋酸盐含量测定回收率结果

2.5.5 重复性试验精密量取本品（批号：20060702）适量，共6份，照含量测定项下方法测定其含量。结果表明：重复性良好。见表7。

2.5.6 样品溶液的稳定性试验取本品（批号：20060702）适量，用水溶解稀释至每毫升含赖氨酸醋酸盐105μg/mL的溶液，分别于 0、2、4、6、8 h 时，精密量取供试品溶液 400 μL 与衍生化试液200μL反应，振荡30 s，准确控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。见表8。

表7 复方α-酮酸含量测定重复性试验

表8 溶液稳定性试验

结果表明：本品以水作溶媒，在8 h内测定，其峰面积无显著变化，稳定性较好。

2.5.7 中间精密度试验取本品（批号：20060702）A，B两份，分别用Waters和岛津的仪器于二日内测定其含量，比较其中间精密度。结果RSD分别为0.69%、0.73%和1.23%，表明中间精密度良好，提示本品含量测定方法经方法学验证，专属性、重复性、精密度、准确度等皆符合要求。

2.6 结果

取本品10片，去除包衣，精密称定，研细，精密称取细粉适量（约相当于的赖氨酸醋酸盐约10.5 mg），置100 mL量瓶中，加水溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取赖氨酸醋酸盐约35 g，苏氨酸约18 mg，氨酸约13 mg，酪氨酸约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取30 mL，加水溶液稀释至100 mL，摇匀，作为对照品溶液。精密量取供试品溶液和对照品溶液各400μL分别与衍生化试液[精密称取邻苯二甲醛（OPA）0.025 g，用甲醇 1 mL 溶解，加 100 μL 2-巯基乙醇，0.4 mol/L硼酸溶液（PH 9.5，用氢氧化钠溶液调节）定容至10 mL（当天配制）]200μL反应，振荡30 s，准确控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算各种氨基酸的含量。三批样品结果见表8。