高压氧治疗对颅脑损伤大鼠谷胱甘肽过氧化物酶及丙二醛的影响

张 良 杨 晨 潘树义 张 禹

海军总医院全军高压氧中心，北京 100048

创伤性颅脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是临床常见病、多发病，由于病情危重、变化急骤，其总体死亡率和致残率一直居高不下，严重威胁人们生命安全，且TBI治疗耗费大量的医疗资源，增加社会负担，所以探求有效治疗TBI的方法具有重要的临床意义。

传统治疗TBI的方法是早期实施外科手术，同时结合药物、亚低温手段。随着神经外科技术的发展和重症医疗救护能力的提高，绝大多数患者都能得到及时救治，特别是早期实施开颅减压能减轻脑水肿对正常脑组织进一步损害，挽救患者的生命。但后期TBI患者神经功能的缺失却一直是无法解决的问题，患者无法生活自理，甚至一些患者呈永久植物状态生存。经多中心临床研究表明，药物及亚低温治疗对重型TBI患者功能恢复并无太多益处[1-4]。而高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）作为一种新生的治疗手段，经研究证实，不仅可以在早期起到降低颅内压[5-7]、减轻脑水肿[8]的“内科减压”治疗作用，同时在细胞及亚细胞水平上阻断脑水肿病理过程的进一步发展，防止二次损伤[9-11]，对后期神经功能改善起到积极的治疗作用[12-13]，但HBO是否增加氧化损伤一直存在争论。

本实验通过比较脑损伤组、HBO治疗组及空白对照组大鼠脑血清谷胱甘肽过氧化物酶 （glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量的差别，寻找TBI模型大鼠氧化-抗氧化指标在HBO治疗干预下的变化规律，为临床HBO治疗TBI患者提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

液压撞击仪系统 （HPD-1700，31.28 mV/psi， 美国Dragenfly有限公司生产），电子天平（YP1200，上海第二天平仪器厂生产），电动牙科打磨机（90型，佛山市安友伴医疗器械有限公司生产），电动离心机（KA100，上海安亭科学仪器厂生产），单人纯氧舱（NG90-ⅢBd单人医用高压氧舱，宁波高压氧舱总厂生产），分光光度计（ultrospec 3000 pro分光光度计，由海军总医院中心实验室提供）。GSH-Px活力、MDA含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验分组及HBO治疗方案

雄性Wistar大鼠80只随机分为8组，每组10只，其中1～4组为脑损伤组，分别于建模后24 h内、第5天、第10天、第15天处死；5～7组为HBO治疗组，5组建模当天开始行HBO治疗至第5天处死，6组建模后第5天开始行HBO治疗至第10天处死，7组建模后第10天开始行HBO治疗至第15天处死；8组为空白对照组。按损伤后阶段划分，2组（脑损伤组）与5组（HBO治疗组）、3组与6组、4组与7组相对应。脑损伤组与HBO治疗组大鼠都进行液压撞击建立模型，治疗组大鼠行HBO治疗，治疗压力2.0 ATA，氧气洗舱时间5 min，加压时间 5 min，减压时间 5 min，稳压吸氧 45 min，舱内温度（23.3±2）℃。 1次/d，共 5次。

1.3 TBI模型的建立

采用侧位液压撞击（lateral fluid percussion，LFP）法建立TBI大鼠模型[14-15]，清洁级雄性Wistar大鼠（中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，批号：SCXK-（军）2007-004，共 80 只，体重（276±26）g。 大鼠术前均禁食 12h，禁水 6 h[16]，称重后以10%水合氯醛（按3.5 g/kg麻醉剂量）[17]腹腔内注射麻醉后，俯卧位于固定板上固定，去除大鼠头部正中线处毛发暴露皮肤，安尔碘常规消毒。沿正中线由颅底部向鼻部剪开头皮，钝性分离头皮下筋膜直至右侧冠状缝至人字缝之间颅骨完全暴露。使用电动牙科打磨机于矢状缝右侧4 mm、冠状缝后侧4 mm交点处钻孔，钻孔直径约4 mm，穿透颅骨，硬脑膜完整[18]。以37℃生理盐水注入撞击仪储液装置内，连接大鼠露骨钻孔处，按电压-力量换算公式计算打击力度的电压值[19-20]，使用相同重锤下落高度，液压撞击仪撞击1次，经示波器读取电压值，换算为打击力度。撞击结束后安尔碘常规消毒切开皮肤，缝合头皮。

根据文献选择打击力度，通过调节重锤下落距离调整打击力量，调节至示波器显示（1.24±0.023）v[（273.27±5.07）kPa，中～重度损伤][20]。

1.4 指标测定

GSH-Px活力测定采用比色法，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料统计学描述采用均数±标准差（x±s）。表示。多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组总体GSH-Px活力、MDA含量比较

结果显示，GSH-Px活力损伤组显著低于空白对照组（P＜0.01），治疗组显著高于损伤组（P＜0.01）；MDA含量损伤组显著高于空白对照组（P＜0.01）。见表1。

表1 各组总体GSH-Px活力、MDA含量比较（x±s）

2.2 各组不同阶段GSH-Px活力、MDA含量比较

GSH-Px活力不同阶段治疗组均高于相应时期损伤组，其中6组 （建模后第5天开始行HBO治疗至第10天处死）显著高于3组（建模后第10天处死）（P＜0.01），损伤组1至4组呈时间相关性升高；MDA含量损伤组1至4组呈时间相关性下降，其中1、2组均显著高于空白对照组（P＜0.01）。见表2。

表2 不同阶段脑损伤组、HBO治疗组与空白对照组GSH-Px活力、MDA 含量比较（x±s，n=10）

3 讨论

TBI发生后，损伤局部脑血流量减低、氧弥散功能障碍导致损伤局部脑组织缺血缺氧，有氧代谢减少、无氧代谢增加，结果是酸性产物增多、细胞能量消耗增加。能量供给不足，细胞膜转运功能失调，发生细胞内钙离子超载等细胞内水、电解质紊乱。异常的细胞内环境导致兴奋性氨基酸及大量自由基释放。大量自由基释放作用于生物体膜结构，导致细胞膜及亚细胞膜（如线粒体）结构及功能损害，进而引发以脂质过氧化反应（lipid peroxidation，LP）为主要机制的病理生理变化过程[4]。所以，TBI发生后机体发生氧化应激（oxidative stress，OS）损伤是一个必然的病理过程，其实质是氧化-抗氧化不平衡[21]，即活性氧过量生成和/或抗氧化防御系统受损，导致超氧阴离子（O2）、过氧化氢（H2O2）等氧自由基及其相关代谢产物过量聚集，而对细胞产生多种毒性作用。在这个过程中，GSH-Px作为清除自由基主要组成部分，反映机体的抗氧化能力；MDA为膜结构发生脂质过氧化反应的代谢产物，间接反映氧化损伤的程度。

HBO作为TBI治疗的一种重要手段已得到一致认可，它可以改善损伤后局部组织缺氧、减轻水肿，而目前HBO治疗是否增加氧化损伤仍存在争议。本实验中，脑损伤组与空白对照组比较，GSH-Px活力显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.01），说明TBI模型大鼠损伤后存在明显的氧化-抗氧化失衡，氧化损伤明显。同时，脑损伤组GSH-Px呈时间相关性升高，且均低于空白对照组；MDA含量呈现时间相关性降低，直至第15天仍高于空白对照组，说明TBI模型大鼠氧化应激在1～2 d达到高峰后，机体自身的抗氧化能力缓慢提高，但仍处于氧化-抗氧化失衡状态。

本实验还发现HBO治疗组与脑损伤组比较，GSH-Px活性显著升高（P＜0.01），提示HBO治疗使模型大鼠抗氧化能力明显增强，氧化-抗氧化平衡明显向对抗OS的方向发展，氧化损伤有减轻的趋势。而在这个过程中，笔者观察到6组（损伤第5天开始行HBO治疗）GSH-Px活力最高，甚至高于空白对照组，MDA含量除空白对照组外最低，且6组与3组（时间相对应损伤组）比较，GSH-Px活力显著升高 （P＜0.01），MDA 含量降低（P=0.066）。同时，7 组（损伤后 10 天开始行HBO治疗）GSH-Px活力低于6组，MDA含量与6组相同，提示在TBI模型大鼠损伤后早期特定时间段内（第5天）给予HBO治疗，能够极大的提高抗氧化能力，使氧化-抗氧化平衡短时间内迅速向抗氧化能力提高方向发展，最大程度的减少氧化损伤，而如果在上述特定的时间之前给予HBO治疗，对于提高模型大鼠抗氧化能力的作用减弱，甚至有可能使氧化-抗氧化平衡向氧化损伤加重的方向发展，提示临床HBO治疗有治疗时间窗问题，即在TBI极早期氧化应激尚处于最明显阶段给予HBO治疗并不是最佳时机，而在机体抗氧化能力逐渐提高的特定时期给予HBO治疗，能够获得很好的提高抗氧化能力、减轻氧化损伤的效果。

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