丝素蛋白／改性Fe3 O4纳米粒子复合材料的制备

王 俊， 徐倩倩， 黄 超， 张 柯， 徐叶叶， 鲁 丹， 黄毅萍

（安徽大学 化学化工学院，安徽 合肥 230039）

0 引言

有机高分子与无机磁性纳米粒子的复合材料已成为当前研究的热点，随着其在生物医学领域的发展，广泛应用于蛋白质分离技术［1］、DNA与药物载体等医学领域［2］。

丝素蛋白是一种天然高分子纤维蛋白质，以其优异的力学性质、耐热绝缘和光泽鲜亮等特性被誉为“纤维皇后”。更因其良好的生物相容性、可降解性、优良的透氧、透水性能，从纺织品到生物医药，已经有了广泛的应用［3－4］。目前丝素蛋白的研究领域包括人工韧带和血管、软骨和骨组织工程及丝素蛋白神经组织工程。根据六氟异丙醇与丝蛋白复合产物在小鼠身体组织的免疫研究，以及鼠细胞L2929在丝素蛋白膜上生长情况表明，丝素蛋白和胶原蛋白一样，能够促进细胞的增长，生物相容性能良好［5］。有研究采用蚕丝与软骨细胞进行复合培养，探索了蚕丝作为软骨细胞体外培养支架的可行性，发现蚕丝对软骨细胞具有良好的吸附作用，并能维持软骨细胞正常形态和功能，是适合软骨细胞立体培养的良好的天然支架。而丝素蛋白用于人工丝制韧带的制作，证明了丝素蛋白具有良好的力学性质、生物相容性以及缓慢的降解性，是良好的支架材料［6］。

磁性Fe3O4纳米粒子不仅应用于磁记录材料，还应用于磁医疗及磁感应材料等领域［7－9］。纳米材料制备的药物载体具有体积小、易穿透血脑屏障、在机体内易降解等优点［10］。因顺磁性纳米氧化铁的表面积效应，在其表面包覆高分子聚合物的葡聚糖形成核壳式结构后，能进一步制成携带多肽、基因或脂肪酸等，使其成为分子成像与治疗顺磁性的药物载体系统［11］，磁性药物微球以适当的方式引入人体，在外加磁场的作用下，进行其位点特异性的物理化学靶向性治疗［12］。用γ－氨丙基三乙氧基硅烷修饰Fe3O4与药物复合，对药物的包覆具有可控性，医学实验表明复合效果良好［13］。文献［14］使用磁性纳米颗粒技术，发现了潜伏在人体体液和组织样本中的病毒。关于磁性材料在生物体内的研究与应用发展迅速，具有磁性感应的药物研究成为当今医学界研究的重点与热点，Fe3O4纳米粒子与有机高分子的复合成为新型药物材料的新方法。

丝素蛋白与无机纳米材料的复合仍处于初步发展阶段，而合成含有磁性纳米粒子的丝素蛋白复合材料在国内外报道中并不多。利用丝蛋白作为生物载体材料具有良好的相容性与降解性以及磁性纳米氧化铁的磁感应性，本实验制备含有磁性纳米粒子的丝素蛋白复合材料，有望成为一种新型药物载体材料。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

蚕茧（家蚕，安徽农业大学科学研究所）；Na2CO3（国药集团，分析纯）；LiBr（天津博迪，化学纯）；透析袋（上海源叶生物科技有限公司，截留分子量14 000）；FeCl3、FeCl2·4H2O、HCl、还原性铁粉、KOH、油酸钠、高纯氮、乙醇（国药集团，分析纯）。

高分辨透射电子显微镜（JEM－2100，日本电子）；扫描式电子显微镜（S－4800，日立）；傅里叶红外光谱仪（NEXUS－870，尼高力仪器公司）；振动样品磁强计（BHV－55，理研电子株式会）。

1.2 丝素蛋白溶液制备

将剪成丝状的蚕茧放入Na2CO3质量分数为0.5%、温度为98～100℃的水溶液中脱胶，重复上述操作2次。用90℃的热水冲洗若干次，最后在常温下用离子水冲洗一遍。将脱胶的丝素蛋白放置于温度为50℃烘箱中干燥。将干燥的丝素蛋白溶解于60℃、9.5mol／L的溴化锂溶液中，溶液经透析72h，高速离心分离除去其中的杂质，获得丝素蛋白溶液。称量法测定丝素蛋白质量分数。

1.3 共沉淀法制备磁性纳米粒

1.3.1 油酸钠改性

FeCl3用去离子水溶解，过滤，取滤液。FeCl2·4H2O用去离子水溶解，加入少量还原性的Fe粉、盐酸，调节pH值为2，升温至60℃，恒温15min，冷却至室温，过滤，取滤液。取0.1g的油酸钠，将FeCl3溶液、FeCl2溶液和油酸钠分别注入通有氮气的三口烧瓶中，边加KOH溶液边搅拌，至pH值为11～13，获得黑色的溶液。陈化0.5h。对上述溶液抽滤，并用蒸馏水多次洗涤，再用乙醇多次洗涤。在60℃干燥，研磨。

1.3.2 PEG改性

取0.1g的聚乙二醇4 000，将FeCl3溶液、FeCl2溶液和聚乙二醇在碱性条件下搅拌，获得黑色的溶液，陈化30min。对上述溶液抽滤，并用蒸馏水多次洗涤，再用乙醇多次洗涤。在60℃干燥，研磨。

1.4 丝素蛋白与磁性纳米粒子的复合制备

按质量比1∶100、1∶50取油酸钠改性纳米粒子与丝素蛋白溶液，同样以1∶50、1∶100、1∶200取PEG改性纳米粒子与丝素蛋白溶液。用乙醇在超声条件下分散改性的纳米粒子，将已经分散的纳米粒子加入到丝素蛋白溶液中超声，直至形成固定的凝胶状物质。将上述凝胶状物质放在温度为60℃的干燥箱中干燥。

1.5 产物表征

将样品与溴化钾研磨、压片制样，用NEXUS－870傅里叶红外光谱仪测试，采样32次，分辨率为2cm－1，测试范围为4 000～400cm－1。分别以乙醇超声分散油酸钠改性纳米粒子、PEG改性纳米粒子、油酸钠改性的纳米粒子与丝素蛋白的复合产物、聚乙二醇改性的纳米粒子与丝素蛋白的复合产物，用铜网捞起，用JEM－2100高分辨透射电子显微镜在200kV条件下检测产物。对油酸钠改性的纳米粒子与丝素蛋白的复合产物干燥后切片，用S－4800扫描式电子显微镜在1.0kV条件下检测，获得产物断面形貌照片。用BHV－55型振动样品磁强计检测油酸钠改性的纳米粒子与丝素蛋白复合干燥粉末状物质，获得复合产物的磁滞回线。

2 结果与讨论

2.1 修饰基团对Fe3O4纳米粒子改性的影响

样品红外光谱图如图1所示，从图1可看出，583cm－1为氧化铁的特征吸收峰，2 800～2 900cm－1范围内吸收明显，说明—CH2—与—CH3基 团 较 多，2 923cm－1为 油 酸 长 链—CH2—吸收峰，1 525cm－1为羧酸根的对称伸缩振动吸收峰，1 404cm－1为C—H弯曲振动吸收峰；1 340cm－1为C—O伸缩振动峰。结果可定性说明油酸钠与聚乙二醇改性Fe3O4较好。

图1 样品红外光谱图

将3组粒子在同等条件下分散在乙醇溶液中，未改性的Fe3O4纳米粒子的TEM照片如图2a所示，由图2a可看出，纳米粒子的粒径为10nm左右，出现一定程度的团聚；油酸钠改性的Fe3O4纳米粒子TEM照片如图2b所示，油酸钠改性的Fe3O4纳米粒子粒径在15nm左右，分散较为均匀；PEG改性的Fe3O4纳米粒子TEM照片如图2c所示，粒径为20nm左右，团聚现象明显。由于颗粒在生长过程中总是要趋向于减小表面能，所以颗粒间的聚集过程在合成阶段都会发生。通常采用由表面活性剂、聚合物或其他一些有机分子结合到颗粒表面，提高立体位阻。加入油酸作为表面活性剂吸附到纳米颗粒的表面，得到了能稳定分散的纳米颗粒。而PEG表面带有大量的羟基，羟基被吸附到Fe3O4纳米表面后易与其他羟基结合成团聚结构。

图2 样品的TEM照片

2.2 改性的Fe3O4与丝素蛋白复合

改性的Fe3O4与丝素蛋白复合的红外光谱图如图3所示。

图3 改性的Fe3O4与丝素蛋白复合的红外光谱图

由图3可知，由于纯丝素蛋白在590cm－1附近出现吸收峰，不能通过红外光谱定性判断是否改性纳米粒子复合到丝素蛋白上。

油酸钠改性和PEG改性的磁性纳米粒子与丝素蛋白复合产物的TEM图如图4所示，由图4可以看出，油酸钠改性的磁性纳米粒子在丝素蛋白表面呈点状均匀分布状态，PEG改性的纳米粒子在丝素蛋白呈云状集群分布。可见经过PEG改性的Fe3O4仅能够在部分区域均匀分散到丝素蛋白表面，而油酸钠改性的纳米粒子点状均匀分散。这是因为PEG表面的大量羟基与丝素蛋白的表面的羟基、羧基形成氢键作用，已形成团聚作用；而油酸钠伸出的烷基链与丝素蛋白的残基难以结合，故呈现出点状分散。

图4 油酸钠改性和PEG改性的复合产物TEM图

油酸钠改性Fe3O4纳米粒子与丝素蛋白复合产物的扫描电镜照片如图5所示。由图5可看出，纳米粒子在丝素蛋白的表面较为均匀，表面较为光滑，凹槽处是由于高能电子束打在蛋白质上造成的。

图5 油酸钠改性Fe3O4纳米粒子与丝素蛋白复合产物的SEM

油酸钠改性Fe3O4纳米粒子与丝素蛋白复合产物磁滞回线如图6所示，从图6可知，纳米复合产物在水中分散后，在旁边加一块磁铁，可以很明显地看到复合产物向磁铁方向靠近。经振动样品磁强计检测，1g样品经检测，磁饱和强度为0.249emu／g，剩磁为 0.047emu／g，矫顽力 为200Oe。可见样品的磁性较弱，这是因为Fe3O4纳米粒子与丝素蛋白的质量比非常小。

图6 样品磁性图

3 结束语

本文通过红外与透射电镜检测了2种不同磁性丝素蛋白材料，油酸钠改性后的磁性纳米粒子均匀分布在丝素蛋白上，PEG改性后的磁性纳米粒子不均匀分布在丝素蛋白上；利用丝素蛋白良好的生物相容性及可降解性，探索丝素蛋白与磁性纳米Fe3O4的复合方法。主要用途有：

（1）利用丝素蛋白包裹的磁性颗粒的外磁场响应性和生物兼容性，将药物与适当的磁活性成分配置在药物稳定体系中，在足够强的外磁场作用下，将载体定向于靶区，使其所含药物定位释放，集中在病变部位发挥作用。

（2）检测到精确定位到人体内的病毒表面蛋白或mRNA具有生物磁性，将丝素蛋白包裹的纳米颗粒加入到病人体液试样中或注射到病人身上。如果存在活的病毒，就会和纳米颗粒的抗体黏结在一起，形成一大群颗粒从而被核磁共振仪器检测到。

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