响应面法优化樟芝液态发酵产Antrodin C

夏永军，张贤芳，许赣荣*

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

响应面法优化樟芝液态发酵产Antrodin C

夏永军，张贤芳，许赣荣*

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

分析樟芝液态发酵菌丝体中的活性代谢产物Antrodin C，并以此化合物为目标，采用Plackett-Burman设计和Box-Behnken中心组合响应面分析，对樟芝液态发酵产Antrotin C培养基进行统计学筛选和优化。结果表明：葡萄糖、黄豆粉和MgSO4对Antrodin C的合成影响最为显著。在葡萄糖 72.0g/L、黄豆粉 5.91g/L、MgSO4 0.614g/L时，樟芝液态发酵产Antrodin C最大预测值为178.59mg/L。验证实验Antrodin C实际产量达到(177.83±0.32)mg/L，表明实验建立的模型能较好地预测实际发酵产Antrodin C情况。通过对培养基的优化，樟芝液态发酵Antrodin C产量比优化前(95.72mg/L)提高了85.8%。

樟芝；液态发酵；Antrodin C；鉴定；Plackett-Burman；响应面

樟芝(Antrodia camphorata)是台湾特有的珍稀药用真菌，子实体仅附着于台湾特有的牛樟树中空腐朽内壁生长。长期以来一直被用于解毒、解酒、治疗癌症、止痛等方面，被称为灵芝之王。近年来，研究发现樟芝子实体中含有丰富的三萜、甾醇、多糖、腺苷类化合物，具有抑制癌细胞增生、增加免疫力、抗氧化、抗炎等生理活性[1-6]。但是由于其寄生条件苛刻，且生长极为缓慢，在市场上供给严重短缺，其价格高升至15000美元/kg。

目前，许多学者以人工培养的方式培养牛樟芝，以缓解市场短缺的压力，其中深层液态发酵已经发展成为工业化培养模式。2004年，Nakamura等[7]从樟芝液态发酵菌体中分离得到5种新的马来酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A～E)，是液态发酵樟芝菌体中的主要活性成分，其中Antrodin B和Antrodin C对LLC癌症细胞具有良好的抑制效果。Phuong等[8]研究显示樟芝菌丝体中含有的Antrodin A～E对HCV病毒都具有很好的抑制活性，其中Antrodin A抑制能力最高；研究同时发现在体内Antrodin C可以转化为Antrodin A，从而展现良好的保肝活性，Antrodin A结构式见图1。Wu等[9]研究发现樟芝菌丝体中一种新的马来酸衍生物Antrocinnamomins A能显著的抑制NO的产生。

目前，樟芝液态樟芝液态发酵的研究多注重于菌体多糖[10-13]、抗氧化性[14]等方面的研究，而三萜类化合物由于检测方法和目标化合物不明确，研究很少。对于Antrodins类化合物的研究主要集中于其药理活性，而发酵条件和调控方面未见相关报道。这类化合物是樟芝菌丝体的特征活性产物，与樟芝的保肝等药理活性密切相关。因此，本实验对樟芝液态发酵产Antrodin C的培养基进行统计学筛选和进一步的响应面优化。

图1 化合物Antrodin C结构式Fig.1 Structural formula of antrodin C

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

樟芝菌A.camphorata 上海福茂食用菌有限公司。

1.1.2 试剂

葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、MgSO4、KH2PO4、正己烷、乙酸乙酯、无水乙醇均为国产分析纯试剂；乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯) 德国Meker公司；黄豆粉、豆粕、玉米浆粉 市售。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱系统 美国Agilent公司；液相色谱-质谱仪 美国Waters公司；核磁共振谱仪 瑞士Bruker公司；恒温摇床 太仓市实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 培养基与培养条件

樟芝菌A.camphorata接种于PDA斜面，28℃避光培养9 d，于4℃保藏。

孢子悬浮液制备：取PDA斜面，利用含有吐温-80 (体积分数0.1% )的无菌水25mL洗下茄子瓶斜面的孢子，镜检孢子数达到1×106个/mL。

种子培养基：葡萄糖 20g/L、黄豆粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.5g/L，pH 5.5。液体种子在28℃、110r/min条件下培养4d。

液态发酵基础培养基：葡萄糖50g/L、黄豆粉4g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.5g/L，pH 5.5。接种量为15%，在28℃、110r/min条件下培养7d。

所有培养基均在115℃灭菌20min。

1.3.2 Antrodin C和菌体量分析

1.3.2.1 Antrodin C的确定

取樟芝液态发酵菌体粉末30g，无水乙醇50℃振荡萃取1h，重复萃取两次。将萃取液真空浓缩后用乙酸乙酯-水进行分配萃取，然后浓缩乙酸乙酯层得到樟芝菌体粗提物，4℃放置备用。将樟芝菌体粗提物进行硅胶柱层析，洗脱液为正己烷-乙酸乙酯(体积比为19:1～1:5)，得到10个洗脱组分。将组分6反复进行硅胶柱层析和制备液相，得到化合物AC-2。制备液相色谱条件为：色谱柱：Sepax Sapphire C18(10.0mm×250mm)；流动相：体积比85:15甲醇-水；检测波长254nm。将制备得到的化合物AC-2进行质谱和核磁分析，确认其结构。

1.3.2.2 Antrodin C含量测定

采用HPLC法测定Antrodin C含量。取樟芝菌发酵液100mL，抽滤得到较干菌体，加入少量无水乙醇研磨5min，然后用无水乙醇定容至100mL，50℃振荡萃取1.5h，静置后0.22μm滤膜过滤，进行HPLC分析，分析条件如下：色谱柱：Sepax Amethyst C18(4.6mm×150mm)；流速：1mL/min；检测波长：254nm；流动相A：水-乙酸体积比200:1：流动相B：乙腈；洗脱梯度如下：0～15min，流动相B 50%～100%；15～15.5min，流动相B 100%～50%；15.5～25min，流动相B 50%。

Antrodin C标样由本实验室自行制备，经过UV、MS、NMR、HPLC分析，其纯度≥96%。

1.3.2.3 菌体生物量测定

将发酵液抽滤后，收集菌体，50℃烘干至恒质量，称质量并测定水分。

1.3.3 试验设计

1.3.3.1 Plackett-Burman设计

Plackett-Burman设计是一种筛选关键影响因素的有效方法，特别是针对多变量的试验体系。试验采用12个Plackett-Burman设计，评估11个因素(包括3个虚拟项)对樟芝液态发酵产Antrodin C的影响。每个因素设定两个水平：-1代表低水平，1代表高水平。试验设计的因素和水平如表1所示。不同因素的水平取值是根据前期实验结果而设定的。利用Design Expert 7.0软件对结果进行分析，筛选出显著影响樟芝液态发酵产Antrodin C的因素。

表1 Plackett-Burman试验因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design g/L

1.3.3 响应面试验设计

响应面试验分析同样采用Design Expert 7.0软件。根据Box-Behnken模型的中心组合试验设计原理，设计三因素三水平共15个响应面试验，低中高3个水平分别用-1、0、1代表，试验设计见表2。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3 Plackett-Burman design arrangement and results

2 结果与分析

2.1 Antrodin C的确定和初步测定

分离纯化得到的化合物AC-2为黄色油状液体，UV (乙醇)最大吸收波长为235.2nm，EIMS m/z：330[M+1]+、262、264、173，与文献报道一致[15]。1H NMR和13C NMR的数据与文献报道的Antrodin C一致[7]。确认HPLC图谱中的化合物AC-2就是Antrodin C。前期对碳氮源进行预筛选，测得Antrodin C产量为95.72mg/L。

2.2 Plackett-Burman设计法筛选重要因子

实验过程中每组发酵设定3个平行样，2 8℃、110r/min培养7d，以发酵终期Antrodin C产量为响应值，结果如表3所示，Antrodin C产量变化幅度30.79～141.33mg/L较大，表明实验优化过程对樟芝液态发酵产Antrodin C非常重要。利用Design Expert 7.0软件对实验结果进行分析。

表4 Plackett-Burman试验分析结果Table 4 Analysis of variance for the regression model established based on Plackett-Burman design

由表4可知，回归模型的P值为0.0166(P＜0.05)，说明该模型显著。即该模型在被研究的整个回归区域拟合良好。培养基中各因素对樟芝液态发酵Antrodin C产量(R)的影响效应大小顺序依次为：葡萄糖＞ MgSO4＞黄豆粉＞麦芽糖＞KH2PO4＞豆粕＞蔗糖＞玉米浆粉，其中葡萄糖(P＝0.0084 )、MgSO4(P=0.0099)、黄豆粉(P＝0.0112)是主要的影响因素。其他因素玉米浆粉、麦芽糖、KH2PO4、豆粕、蔗糖虽有影响，但是小于上述3个因素。因此，确定葡萄糖、MgSO4、黄豆粉为影响Antrodin C产量(R)的3个显著性因素，利用响应面分析法对培养基的这3个组分进行更深入的研究。

通过Design Expert软件对数据进行分析，获得多元一次回归方程：

2.3 响应面分析

2.3.1 响应面回归模型的建立和分析

表5 Box-Behnken试验设计下Antrodin C产量分析Table 5 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表6 Box-Behnken试验设计下影响Antrodin C产量回归方程的显著性检验Table 6 Significance analysis for the regression model established based on Box-Behnken design

选取葡萄糖、MgSO4、黄豆粉为自变量，实验设计及结果如表5所示。通过Design Expert软件对实验数据进行二次多项式回归拟合，获得樟芝液态发酵Antrodin C产量(Y)对葡萄糖、黄豆粉、MgSO4的二次多项式回归方程为：

该二次项方程及各项方差分析如表6所示。模型F值为25.49，P值为0.0012，说明模型高度显著。方差分析表明，葡萄糖、黄豆粉、MgSO4的二次项对Antrodin C合成有显著影响。此模型相关系数R2＝0.9787，表明回归方程的拟合程度较好，预测值和实测值之间具有高度的相关性，可以应用于樟芝Antrodin C产量的理论预测。模型中失拟项P值为0.0098，说明由噪音引起模型偏差的概率为0.98%，模型失拟项显著。

2.3.2 显著影响因素的交互作用分析

经Design Expert软件分析可得到3个显著影响因子之间的响应面分析图和等高图，如图2～4所示。响应面分析图谱表示两组独立变量对樟芝液太发酵产Antrodin C的影响，而另外一个因素取0水平值。等高线图谱表示两组独立变量的交互作用是否显著，形状越椭圆说明交互作用影响越显著。由图2～4可知，每组响应面图谱都有明显的顶峰，即影响因素的最佳值落在试验设计的取值范围内。葡萄糖和黄豆粉以及葡萄糖和MgSO4这两组影响因素两两之间的交互作用对Antrodin C的合成均有显著影响。

图2 葡萄糖和黄豆粉交互作用对Antrodin C产量影响Fig.2 Effects of glucose and soybean flour on antrodin C production

图3 葡萄糖和MgSO4交互作用对Antrodin C产量影响Fig.3 Effects of glucose and MgSO4 on antrodin C production

图4 黄豆粉和MgSO4交互作用对Antrodin C产量影响Fig.4 Effects of soybean powder and MgSO4 on antrodin C production

2.4 樟芝液态发酵产Antrodin C最优培养基配方的获取与验证

对模型回归方程进行进一步分析，回归模型存在稳点，稳点为樟芝液态发酵产Antrodin C量最大值，即得到的最优培养基组成为葡萄糖72.0g/L、黄豆粉5.91g/L、MgSO40.614g/L时，理论上樟芝液态发酵培养基Antrodin C产量的最大值为178.59mg/L。

根据上述回归分析结果和响应面试验特点，在实验水平内进行验证，发酵7d后实际Antrodin C产量为(177.83±0.32)mg/L，菌体生物量达到13.4g/L，可见该模型能较好地预测实际产Antrodin C情况。

3 结 论

本实验首次对樟芝液态发酵产Antrodin C的培养基进行统计学筛选和响应面优化。结果显示，统计学优化策略能非常有效的优化调控樟芝液态发酵过程中活性代谢产物。葡萄糖、黄豆粉和MgSO4对Antrodin C的产量影响最为显著。在葡萄糖72.0g/L、黄豆粉5.91g/L、MgSO40.614g/L时Antrodin C产量最大预测值为178.59mg/L。通过实验验证，樟芝液态发酵产Antrodin C产量达到(177.83±0.32)mg/L，比优化前(95.72mg/L)提高了85.8%。实验中发现，麦芽糖对樟芝液态发酵的影响也较大，能够较快的促进樟芝的生长，因此在后续实验中可以考虑利用葡萄糖和麦芽糖的混合碳源进行发酵。

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Optimization of Medium Components for Antrodin C Production by Antrodia camphorata Using Response Surface Methodology

XIA Yong-jun，ZHANG Xian-fang，XU Gan-rong*
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The bioactive compound antrodin C was analyzed in the mycelia of A. camphorata in submerged fermentation. The fermentation medium for antrodin C production was optimized using Plackett-Burman design and response surface methodology. The results showed that glucose, soybean powder flour and MgSO4were the major factors that influence the production of antrodin C. Box-Behnken design and response surface analysis were used to determine the optimal response value of the major factors. A quadratic regression model was established. Based on response surface analysis of the mathematical model, the optimal culture medium composition was determined as glucose 72.0 g/L, soybean flour 5.91 g/L and MgSO4 0.614 g/L. The predicted yield of antrodin C was 178.59 mg/L. After cultivation under the optimal conditions for 7 days, the content of antrodin C reached up to (177.83 ± 0.32) mg/L, which was 85.8% higher than before the optimization (95.72 mg/L).

Antrodia camphorata；submerged fermentation；antrodin C；identification；Plackett-Burman；response surface methodology

Q815

A

1002-6630(2012)11-0185-05

2011-06-08

夏永军(1981—)，男，博士研究生，研究方向为药用真菌人工培养及其活性产物。E-mail：dreamup@126.com

*通信作者：许赣荣(1954—)，男，教授，博士，研究方向为药用真菌培养、生物技术在烟草加工中的应用、粗甘油的高附加值转化。E-mail：grxu123@126.com