枯草芽孢杆菌JMUKC2产肌苷摇瓶发酵培养基的优化

杨尚彤，肖安风,2,3，倪 辉,2,3，杨远帆,2,3，杨 哲，蔡慧农,2,3,*

(1.集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021；2.集美大学食品微生物与酶工程研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

枯草芽孢杆菌JMUKC2产肌苷摇瓶发酵培养基的优化

杨尚彤1，肖安风1,2,3，倪 辉1,2,3，杨远帆1,2,3，杨 哲1，蔡慧农1,2,3,*

(1.集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021；2.集美大学食品微生物与酶工程研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

利用单因素试验和正交试验对肌苷生产菌枯草芽孢杆菌JMUKC2的摇瓶发酵培养基进行优化，优化后的最佳发酵培养基配方为葡萄糖140g/L、玉米浆20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸铵20g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、KH2PO4 7g/L、CaCO3 20g/L。培养基经优化后，生物量比优化前提高了40.67%，肌苷产量比优化前提高了46.57%。

肌苷；枯草芽孢杆菌；摇瓶发酵；培养基优化

肌苷(inosine)又称次黄嘌呤核苷，其分子式为C10H12N4O5，相对分子质量为268.23[1]。肌苷在食品和医药等领域有着非常重要的用途：它是食品中较好的呈味物，其含量常常作为衡量食品“新鲜度”的特征指标之一；它是食品工业中5,-肌苷酸的原料，同时也是各种调味食品(例如味精、酱油等)的营养助鲜剂[2]。在医药上它能预防及解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用[3-5]，是治疗冠心病、肝炎、白血球减少症等的良效药物；同时也是抗生素生产的重要原料[6]。但是，近年来随着韩国、日本等生产厂家对中国市场的冲击，国内的核苷发酵产业面临着严峻的挑战，为此提高发酵得率、降低生产成本，提高生产能力已经成为当务之急[7]。

目前，提高肌苷产量的方法主要包括诱变育种[8-9]、基因工程改造菌种[10]、发酵条件优化[11]等。吴江等[9]通过NTG诱变的方法得到的B. subtilis IFO14189可以积累肌苷15g/L，然而这样可能会引起一些不必要的负突变而且耗时、低效；基因工程技术是一种新兴的技术手段，Shimaoka等[10,12]报道了关键基因中断技术在大肠杆菌中的应用，其中关键基因edd (6-磷酸葡萄糖脱氢酶的关键基因)和pgi (6-磷酸葡萄糖异构酶的关键基因)的中断有利于肌苷的积累，但基因工程技术不易操作且成本较高；而发酵条件的优化是较为简单且成本较低的实验手段[11]。肌苷发酵是典型的代谢控制发酵，优良生产菌种的选育固然是肌苷发酵的关键，但发酵条件的控制对肌苷发酵也有很大的影响[13-14]。樊国燕[15]采用四因素三水平正交试验对枯草芽孢杆菌发酵生产肌苷的培养基进行了优化，考察了葡萄糖、酵母粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4对产苷的影响，优化后的肌苷产量比优化前的肌苷产量提高了20.14%；吕东坡等[6]采用七因素三水平正交试验对枯草芽孢杆菌发酵培养基进行了优化，并确定了其发酵培养基的最佳配方；徐咏全等[16]利用模式识别法对枯草芽孢杆菌发酵生产肌苷的培养基进行了优化，以培养基组成为特征变量构筑模式空间，以肌苷产量为评价目标，通过主成分分析法线性映射，在优类区域寻点逆推回高维空间，得到最优的培养基配方，将肌苷产量提高了26.8%；常景玲等[17]对选育出的优良菌种的发酵培养基通过正交试验设计的方法进行了优化，优化后的肌苷产量比优化前提高了1.5%。

在本实验室的前期研究中，由集美大学生物工程学院发酵工程研究室提供的枯草芽孢杆菌(CICC 20958)经紫外诱变筛选获得了一株高产肌苷的生产菌种枯草芽孢杆菌JMUKC2，并在-70℃条件下于体积分数20%的甘油中保存。本实验从培养基的基本成分入手，利用单因素试验并结合正交试验对枯草芽孢杆菌JMUKC2的发酵培养基成分进行了较为系统完整地优化，确定了其最佳发酵培养基配方，提高了肌苷产量，并为后续罐上工艺的开发提供基础支持。

1 材料与方法

1.1 菌种

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) JMUKC2由集美大学生物工程学院发酵工程研究室提供的枯草芽孢杆菌(CICC 20958)经紫外诱变筛选获得，并在-70℃条件下于20%的甘油中保存。

1.2 培养基

斜面培养基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、琼脂20，pH 7.2；种子培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨10、酵母粉15、玉米浆12、NaCl 2.5、尿素 2，pH 7.2；初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖140、酵母膏15、玉米浆16、尿素13、硫酸铵22、MgSO4·7H2O 2、K2HPO45、CaCO320，pH 7.0。

1.3 试剂与仪器

硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等(均为分析纯) 国药集团化学试剂北京有限公司；酵母膏 英国Dxoid公司；玉米浆(含47.5%干物质) 厦门汇盛生物有限公司；肌苷标准美国Sigma公司；甲醇(色谱纯) 美国天地公司。

Waters 2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；ZHWY-2102双层全温度恒温摇床 上海智诚实验设备有限公司；BS223S电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；Minispin高速离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化

将保存的菌种接种于斜面培养基上，37℃恒温培养18h。

1.3.2 液体种子培养

从活化18h的斜面培养基上取一环菌种转接到装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，220r/min、34℃培养18h。

1.3.3 液体发酵培养

取培养18h的新鲜种子液，以5%接种量接入装有25mL培养基的250mL三角瓶中，220r/min、34℃培养72h。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 生物量测定[18]

取0.2mL的发酵液用蒸馏水稀释30倍，以蒸馏水作空白，用分光光度计在660nm波长处测定其光密度值，用此光密度值表示生物量。

1.3.4.2 肌苷产量测定[19]

采用HPLC法，色谱柱Symmetry型C18反相柱(4.6mm×150mm，3.5μm)，色谱条件：流动相为A：超纯水(含0.5%磷酸)；B：甲醇。梯度程序为：0～3min，100% A；3～9min，92% A，8% B；9～11min，100% B；11～12.42min，100% A。波长：248nm；流速：0.60mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃。

1.3.5 数据处理

所有数据采用统计学软件SPSS 17.0进行差异显著性分析(显著水平α＝0.05)。

2 结果与分析

2.1 碳源对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响

2.1.1 碳源种类的影响

枯草芽孢杆菌为化能异养菌，碳源对其生长代谢会有非常重要的作用。碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要作用构成菌体和合成肌苷的碳架及能量来源[20]。一般的微生物可以在含各种碳水化合物的培养基上良好生长，但它们产物的生产能力和碳源的种类有很大关系。保持摇瓶发酵初始培养基的其他成分不变，固定各碳源含碳量为50.91g/L(以葡萄糖计)，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油为碳源，进行发酵培养，比较不同碳源对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响，结果见图1。

图1 不同碳源种类对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响Fig.1 Effect of carbon source on inosine production during fermentation

由图1可知，当以葡萄糖作碳源时，菌体的生物量及肌苷产量均达到最大，其中肌苷产量比蔗糖作碳源时的肌苷产量高出11.84%，比麦芽糖高出11.14%，比可溶性淀粉高出229.36%，比甘油高出84.10%，故确定其最佳碳源种类为葡萄糖。由于适宜的葡萄糖为菌体的生长既可以提供碳源，又可以提供能量，故菌体生长旺盛，为肌苷生产菌的产苷奠定良好的基础；同时又可以保证充足的能量供产苷期利用，以尽量发挥菌种的产苷潜力，能够较好的满足菌体生长和产苷的需要，因此，以葡萄糖为碳源。

2.1.2 不同葡萄糖质量浓度的影响

图2 不同葡萄糖质量浓度对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响Fig.2 Effect of glucose concentration on inosine production during fermentation

由图2可知，随着葡萄糖质量浓度的增加，肌苷产量和生物量均呈现先上升后下降的趋势，其中当葡萄糖质量浓度为140g/L时，生物量和肌苷产量均达到最大，其中肌苷产量达到2.94g/L。当葡萄糖质量浓度大于140g/L时，肌苷产量和生物量又呈现下降的趋势，故培养基中添加适宜质量浓度的葡萄糖有利于肌苷的发酵，葡萄糖质量浓度过高，可能会使枯草芽孢杆菌代谢产生较多的酸类[21-22]；同时导致菌体细胞渗透压增大，对菌体生长和发酵均有不利影响，不利于肌苷的积累。因此，选择初始葡萄糖质量浓度140g/L进行下一步研究。

2.2 不同氮源质量浓度对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响

氮源不仅是构成枯草芽孢杆菌蛋白质、核酸等含氮物质合成的来源，而且也是肌苷碱基部分合成的来源[20]。由于该发酵培养基中氮源成分较为复杂，根据枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵特性的研究，确定所要考察的4种组分为：酵母膏、玉米浆、尿素、硫酸铵，对此选择四因素三水平正交设计试验进行优化，所得肌苷产量与极差分析结果见表1。

表1 发酵培养基中氮源优化的正交试验结果Table 1 Orthogonal array design and results for the optimization of combined nitrogen sources

由表1极差分析可知，酵母膏对肌苷生产菌JMUKC2生产肌苷的影响最为显著，其次依次为尿素、玉米浆、硫酸铵。由均值分析可知，培养基氮源最优组合为：A3B3C1D2。按照确定的培养基氮源最优组合A3B3C1D2以及9组正交试验中肌苷产量最大组即第6试验组A2B3C1D2进行重复验证，结果显示A3B3C1D2产肌苷为4.27g/L大于A2B3C1D2组合下的肌苷产量(4.01g/L)，故可确定枯草芽孢杆菌发酵产肌苷的最优氮源组合为A3B3C1D2，即酵母膏17g/L、玉米浆20g/L、尿素7g/L、硫酸铵20g/L。

2.3 磷酸盐对枯草芽孢菌JMUKC2发酵产肌苷的影响

2.3.1 磷酸盐种类的影响

无机盐是微生物生命活动中所不可缺少的物质：可以构成菌体成分；作为酶的激活剂或抑制剂；调节培养基的渗透压以及调节pH值和氧化还原电位等[23]。本实验按初始培养基配比，恒定CaCO3加入量20g/L，考察磷酸盐和镁离子对枯草芽孢杆JMLIKC2发酵产肌苷的影响。保持培养基的其他成分不变，固定各磷酸盐含磷量0.89g/L(以KH2PO4计)，分别以K2HPO4、KH2PO4、K2HPO4＋KH2PO4为磷酸盐，进行发酵培养，比较不同磷酸盐对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响，结果见图3。

图3 不同磷酸盐种类对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响Fig.3 Effect of phosphate type on inosine production during fermentation

由图3可知，培养基中单独添加KH2PO4时肌苷产量和生物量均达到最大，其中生物量比K2HPO4所得生物量高出7.74%，比等量的K2HPO4和K0H2PO4所得生物量高出9.24%；单独添加KH2PO4时肌苷产量为4.59g/L，比KH2PO4所得肌苷产量高出4.08%，比添加等量的K2HPO4和KH2PO4所得肌苷产量高出19.22%。KH2PO4在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着非常重要的作用：一方面，KH2PO4提供的磷是构成核酸磷脂、许多辅酶或辅基(辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、辅酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料[24]；另一方面，KH2PO4在代谢调节方面也起着重要的作用，能促进糖代谢的进行，有利于微生物的生长[25]。因此，磷酸盐是枯草芽孢杆菌发酵培养基中另一个重要的组成成分，它的浓度大小直接影响着枯草芽孢杆菌菌体的生长和芽孢的形成。

2.3.2 不同质量浓度KH2PO4的影响

图4 不同质量浓度KH2PO4对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响Fig.4 Effect of KH2PO4 concentration on inosine production during fermentation

由图4可知，随着KH2PO4质量浓度的增大，枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵72h后的生物量和所得肌苷产量均呈现先上升后下降的趋势，其中当培养基中KH2PO4的质量浓度为7g/L时生物量和肌苷产量均达到最大：OD660nm值为24.53，比优化前提高了10.12%；肌苷产量为4.48g/L，比优化前提高了10.12%。KH2PO4的添加能解除ATP 对1,6-二磷酸果糖激酶的抑制，而磷酸果糖激酶是糖酵解途径中的关键酶[25]，因而KH2PO4的添加可以改变枯草芽孢杆菌肌苷合成途径中的代谢流分布，进而增大了肌苷合成的代谢通量，实现肌苷产量的增加。因此，选择7g/L的KH2PO4进行下一步研究。

2.4 不同质量浓度的镁离子对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响

基于上述培养基成分优化结果(葡萄糖140g/L、玉米浆20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO47g/L)，分别考察0、1、2、3、4g/L的硫酸镁对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响，结果见图5。

图5 不同质量浓度的MgSO4·7H2O对枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵产肌苷的影响Fig.5 Effect of MgSO4·7H2O concentration on inosine production during fermentation

由图5可知，随着MgSO4·7H2O质量浓度的增大，枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵72h后的生物量和所得肌苷产量大体上均呈现先上升后下降的趋势，其中当培养基中MgSO4·7H2O的添加质量浓度在1g/L时生物量和肌苷产量均达到最大，OD660nm值比优化前提高了4.12%；肌苷产量达到了4.50g/L，比优化前提高了23.97%。由于Mg2+能与ATP结合形成ATP复合物，此复合物对己糖激酶(HK)有很强的激活作用，加快了6-磷酸葡萄糖的合成速率[26]，从而加快了肌苷合成的速率；但过多Mg2+的添加容易和微生物的蛋白质结合而发生变性或沉淀[27]，对枯草芽孢杆菌的生长和发酵均有不利影响。因此，添加适量的Mg2+有利于肌苷的积累。

2.5 发酵培养基优化前后肌苷产量对比

通过以上实验，初步优化得到了枯草芽孢杆菌JMUKC2产肌苷的发酵培养基为葡萄糖140g/L、玉米浆20g/L、酵母膏17g/L、尿素7g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO47g/L、MgSO4·7H2O 1g/L。在此条件下，与最初的发酵培养基发酵结果进行对比，结果见图6。

图6 培养基优化前后肌苷产量的对比Fig.6 Comparisons of inosine production biomass before and after the optimization

由图6可知，枯草芽孢杆菌JMUKC2在优化后的发酵培养基中培养72h后， OD660nm值为17.17，肌苷产量可达4.91g/L，比初始培养基分别提高了40.67%和46.57%。

3 结 论

本实验利用单因素试验和正交试验相结合的方法，采用较少的实验找出各因素之间的相互关系，对肌苷产生菌枯草芽孢杆菌JMUKC2发酵培养基进行了优化，优化后的发酵培养基最佳配方为：葡萄糖 140g/L、酵母膏17g/L、玉米浆20g/L、尿素7g/L、硫酸铵20g/L、KH2PO47g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、CaCO320g/L。优化后的生物量和肌苷产量均比优化前有较大的提高：比初始培养基分别提高了40.67%和46.57%。

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Culture Medium Optimization for Inosine Production by Bacillus subtilis JMUKC2 in Shake Flasks

YANG Shang-tong1，XIAO An-feng1,2,3，NI Hui1,2,3，YANG Yuan-fan1,2,3，YANG Zhe1，CAI Hui-nong1,2,3,*
(1. College of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China；2. Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology, Jimei University, Xiamen 361021, China；3. Food Bioenginering Research Center of Xiamen, Xiamen 361021, China)

This paper describes the optimization of the fermentation medium for inosine-overproducing Bacillus subtilis JMUKC2 in shakes flask using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The optimal fermentation medium was composed of 140 g/L glucose, 20 g/L corn liquor, 17 g/L yeast, 7 g/L urea, 20 g/L ammonium sulfate, 1 g/L MgSO4·7H2O, 7 g/L KH2PO4and 20 g/L CaCO3. The resulting biomass and inosine production were increased by 40.67% and 46.57% compared with those before the optimization, respectively.

inosine；Bacillus subtilis；shake flask fermentation；culture medium optimization

TS201.3

A

1002-6630(2012)11-0167-05

2012-02-24

福建省自然科学基金项目(2011J01225)；集美大学中青年创新团队专项(2010A006)；集美大学科研基金项目(2010N5009)

杨尚彤(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品微生物。E-mail：yangshangtong@yahoo.com.cn

*通信作者：蔡慧农(1957—)，男，教授，硕士，研究方向为食品发酵工程。E-mail：huinongcai@163.com